第一篇 植物细胞工程实验技术
第一章 基础性实验
实验1-1 植物培养基母液的配制
一、实验目的
1．了解植物外植体离体培养所需的各种营养成分及植物生长调节物质的种类。
2．掌握植物组织与器官离体培养基本培养基母液（以MS培养基为例）与植物生长调节物质母液的配制方法。
二、实验原理
植物组织培养基（plant culture medium）是植物离体组织和细胞赖以生存的营养基质，为离体培养材料提供接近活体生存的营养环境，不同材料对培养基的要求不同。
植物组织培养基主要包括水、无机营养物、有机物、碳源和植物生长调节物质。无机营养物包括大量元素和微量元素，大量元素包括碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、镁，它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶、叶绿素等不可缺少的元素。微量元素包括铁、锰、硼、锌、铜、钼、氯、钴等，其需要量很少。培养基中通常添加蔗糖，其可作为植物生长发育的能源和碳源，还可调节培养基的渗透压。有机复合物中常使用B族维生素，如盐酸硫胺素（维生素B1）和盐酸吡哆醇（维生素B6），它们与各种酶的形成有关。培养基中重要的有机氮源是一些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺等，它们影响着培养物的生长发育。在液体培养基中添加琼脂等固体支持物质，就会得到固体培养基。在人工合成的培养基中，固体培养基是最常用的类型。
在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分、生长因子、理化环境等主要由培养基提供，对组织培养物的脱分化、再分化及次生代谢物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。植物生长调节物质在培养基中对外植体愈伤组织的诱导和分化起着重要的调节作用。Skoog和 Miller最早在1955年提出了生长素和细胞分裂素相对浓度可以调节器官分化的理论，即相对高的生长素浓度有利于细胞增殖和不定根的分化，而相对高的细胞分裂素浓度有利于不定芽的分化。
在配制培养基前，为了操作方便和用量准确，首先要将培养基各成分按配方浓度扩大一定倍数，单独或混合配制成母液，储存在冰箱中，用时再根据培养基实际用量按比例稀释。植物器官和组织培养常用的基本培养基有MS、LS、Miller、Nitsch、H、White、B5和N6等，本实验以MS培养基（Murashige and Skoog，1962）为例，学习植物培养基母液的配制方法。
三、实验器具与试剂
1．仪器用具 电子天平（感量分别为千分之一和万分之一）、电磁炉、烘箱、药匙、玻璃棒、称量纸、滤纸、滴管、洗瓶、试管、锥形瓶、烧杯（200mL、100mL、50mL）、容量瓶（1000mL、500mL、100mL）、试剂瓶（1000mL、500mL、200mL、100mL）、量杯、量筒、移液管、吸耳球、移液器及枪头、封口膜、棉绳、定性滤纸、标签纸、记号笔、剪刀、镊子等。
2．试剂
（1）1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。
（2）MS培养基，其各营养成分见表1-1-1。
表1-1-1 MS培养基各营养成分
（3）植物生长调节物质：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、激动素（KT）等。
（4）洗涤剂。
四、实验步骤
（一）器皿、用具的清洗
（1）将已使用过的试管、烧杯、锥形瓶、容量瓶、试剂瓶等，除去残渣，用
清水洗净，再用洗涤剂溶液洗刷，然后用清水冲洗干净，最后用蒸馏水润洗一次，倒置、控干水分，或放入50～60℃烘箱中烘干。
（2）用过的移液管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入洗涤剂溶液中浸泡，再用流水冲洗干净，然后用蒸馏水淋洗一遍，烘干或自然晾干。
（二）培养基母液的配制
下面以MS培养基为例，说明培养基母液的配制方法（MS培养基的各成分用量见表1-1-1）。
1．大量元素母液的配制 根据培养基配方的用量，把各种化合物浓度分别扩大10倍，按照表1-1-2中的次序将化合物用感量为千分之一的电子天平准确称量，分别置于50mL烧杯中，加入30～40mL蒸馏水溶解（可以加热至60～70℃，促其溶解）。溶解后，按顺序分别倒入1000mL容量瓶中，最后混匀定容。注意，为了避免盐浓度过高使钙离子与磷酸根形成不溶于水的沉淀，需要最后加入CaCl2溶液（溶解CaCl2的蒸馏水不需加热），也可将CaCl2母液单独配制。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，保存于4℃冰箱中待用。
表1-1-2 MS培养基大量元素母液的制备
2．微量元素母液的配制 按照培养基配方的用量（表1-1-3），将微量元素各种化合物（除去铁盐）浓度扩大1000倍，用感量为万分之一的电子天平分别准确称取，混合溶解，最后定容至 100mL容量瓶中。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，保存于冰箱中。注意，由于CuSO4 5H2O和CoCl2 6H2O的称取量太少，可以再增加扩大倍数称取，单独配制一定体积的浓缩母液，取一定量浓缩母液稀释后，再加入其他微量元素混合。
3．铁盐母液的配制 常用的铁盐是FeSO4和EDTA-Na2的螯合物，必
须单独配成母液，这样使用方便，又比较稳定。配制时，按照扩大200倍后的用量（表1-1-4）分别称取FeSO4 7H2O和EDTA-Na2 2H2O，分别加水溶解，EDTA-Na2 2H2O需加热溶解。再将FeSO4 7H2O溶液缓缓倒入EDTA-Na2 2H2O溶液中，用玻璃棒不断搅匀使其充分螯合，定容后贮存于棕色玻璃瓶中，并保存于4℃冰箱中，以防止氧化。
表1-1-3 MS培养基微量元素母液的制备
表1-1-4 MS培养基铁盐母液的制备
4．有机复合物母液的配制 按照表1-1-5中扩大100倍后的用量，用感量为万分之一的电子天平分别称取各有机物，配制混合母液。其中肌醇的用量较大，也可以不配母液，用前直接称取固体。母液配好后，写好标签，放入4℃冰箱中保存。注意，一般有机物都溶于水。如果试剂中需要其他有机物质，如叶酸（维生素B9）需先用少量稀氨水或1mol/L NaOH溶液溶解，生物素（维生素H）则先用1mol/L NaOH溶液溶解，维生素A、维生素D3、维生素B12应先用95%乙醇溶解后，再用蒸馏水定容。
表1-1-5 MS培养基有机复合物母液的制备
5．植物生长调节物质母液的配制 植物生长调节物质的母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是0.2～2mg/mL。称量植物生长调节物质要用感量为万分之一的电子天平。配制植物生长调节物质的母液时应注意，各植物生长调节物质的溶剂不同，具体见表1-1-6。
表1-1-6 植物组织培养中常用的生长调节物质的溶剂
实验中，可分别配制1mg/mL 2，4-D母液100mL、1mg/mL 6-BA母液100mL、0.5mg/mL NAA母液100mL，称取量见表1-1-7。
表1-1-7 生长调节物质母液的配制
配制2，4-D 母液时，先用少量（1～3mL）95%乙醇（也可用1mol/L NaOH溶液或1mol/L KOH溶液使其中和成为钠盐或钾盐），充分溶解2，4-D固体粉末，然后缓慢加入蒸馏水，不断搅拌混匀，最终定容至需要的体积。配制IAA母液时，可以先用少量95%乙醇使固体充分溶解，然后再缓慢加入蒸馏水定容至需要的体积。KT和6-BA 等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L HCl溶液溶解后再稀释至所需浓度。赤霉酸（GA3）水溶液的稳定性较差，一般
展开
