第一篇 基本实验操作
及常用仪器使用
第一章 基本实验操作
第一节 离心技术
离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域中已得到十分广泛的应用。该技术是蛋白质、酶、核酸及细胞亚显微结构分离的*常用的方法之一，也是生物实验室中常用的分离和纯化的主要手段。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀、微生物菌体、大分子蛋白质、酶反应液、各种提取液或由液-固和液-液组成的悬浮液等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。
离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置，各实验室都配备有多种类型和功能的离心机。它利用不同物质在离心力场中沉淀速度的差异，实现样品的分析分离。
一、基 本 原 理
当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的黏度有关。如：红血细胞大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。
离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。
二、离心机分类
实验用离心机分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为(用离心机中的光学系统连续监测)，能推断物质的纯度、形状和分子量等。分析性离心机都是超速离心机。
1. 制备性离心机 可分为三类：
(1)低速离心机：低速离心机额定转速一般为4000rpm，且连续可调，相对离心力*大可达5000～6000g。适用于医院化验室、生化及分子生物学试验室进行定性分析；血浆、血清、尿素、疫苗制造等。由于此类离心机有大容量的水平及角转子，并配备强大的可调冷冻系统，使得它对于如：病毒、核酸、蛋白、激素及血液组分的分离特别有效和必不可少。同时还可用于瓶装和袋装样品的离心。低速离心机可用于各种细菌、细胞、细胞核等分离，是*广泛使用的一类离心机。
(2)高速离心机：高速离心机*大额定转速为20 000rpm左右，*大相对离心力可达45 000g。由于运转速度高一般配备冷冻控温装置。高速离心机适用于各种生物细胞、病毒、血清蛋白等有机物、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液等样品的分离、浓缩、提取等制备工作，是细胞和分子水平研究工作的基本工具。
(3)超速离心机：可分为制备与分析两种。制备的*高额定转速为55 000～83 000rpm，目前已经达到120 000rpm，*大相对离心力在6×105g以上。超速离心机是医学、检验学、生物学、生物化学、分子生物学、农业等各领域和专业的重要仪器之一。由于其转速极高、相对离心力极大，所以，对离心机、转子和离心管等材料和质量要求极高。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等。
2. 分析性离心机 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。
分析性超速离心机的主要特点就是能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息，能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例，测定生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子的构象变化等。
三、操 作 方 法
(1)检查离心机调速旋钮是否处在零位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。
(2)接通离心机电源，打开机器开关，等待机器自检完毕。
(3)离心前，先将离心的物质转移入合适的离心管中，其量以距离心管口1～2cm为宜，以免在离心时甩出。将离心管放入外套管中，在外套管与离心管间注入缓冲水，使离心管不易破损。
(4)根据转子选择适合的离心管，将样品装入一对离心管后，在托盘天平上调节使它们质量相等，然后对称的放入转子中，先将转子的盖子旋紧，然后盖上机器盖。
(5)根据需要依次设置离心所需要的温度、运行程序(可不选择)、转速、离心时间(当触及某一项的按键时，显示屏上相对应的值会闪烁，设完一个参数可直接触及下一个按键，继续设定所需数值)，设置结束后按“start/stop”开始运行机器。
(6)离心完毕，将手柄慢慢地调回零位。关闭开关。切断电源。
(7)待离心机自行停止转动时，才可打开机盖，取出离心样品。
(8)将离心管处理干净，倒置在小张滤纸上使其干燥，以便下次使用。旋上转子盖，关上机盖。若离心室内壁有冰霜待其化净干燥后，再旋上转子盖，关上机盖。
四、注 意 事 项
实验室常用的是电动离心机，电动离心机转动速度快，要注意安全，特别要防止在离心机运转期间，因不平衡或试管垫老化，而使离心机边工作边移动，一致从实验台上掉下来，或因盖子未盖，离心管因振动而破裂后，玻璃碎片旋转飞出，造成事故。因此，使用离心机时，必须注意以下操作：
(1)离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜。
(2)离心机应接地线，以确保安全。
(3)离心机外套管底部要垫棉花或试管垫。
(4)使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围。
(5)启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。
(6)离心机启动后，如有不正常的噪音及振动时，可能离心管破碎或相对位置上的两管重量不平衡，应立即关机处理。
(7)每个转头各有其*高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。
(8)离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。
(9)分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。
(10)一年检查一次电动机的电刷及轴承磨损情况，必要时更换电刷或轴承。
(11)离心机移动后，*好4h后再使用。转子长期不使用，应取出。使用时在旋转上涂抹润滑油。
(12)离心管的选用：
离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。
塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要；②防止样品挥发；③支持离心管，防止离心管变形。
(刘 丹)
第二节 电 泳 技 术
一、电泳的基本原理
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质有差异，电泳技术就是在电场的作用下，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。
目前使用得*多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
二、电泳的分类
电泳按支持介质的不同可分为：①纸电泳(Paper electrophorisis)；②乙酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)；③琼脂糖凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)；④聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)；⑤SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
(一)纸电泳
纸电泳(Paper electrophorisis)是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。其优点在于或采用滤纸与色素结合的直接电泳图或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。尽管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。
纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH 2～3.5的酸性缓冲液，分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀。点样位置是在滤纸的一端距纸边5～10cm处。样品可点成园形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为5～100mg和5～10ml。
由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。
(二)乙酸纤维薄膜电泳
乙酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似，只是换用了乙酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为乙酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15mm。
乙酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)与纸电泳相比有以下优点：①乙酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰；②快速省时。由于乙酸纤维薄膜亲水性比滤纸小，吸水少，电渗作用小，电泳时大部分电流由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，完成全部电泳操作只需90min左右；③灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2ml血清，点样量甚至少到0.1ml，仅含5mg的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变；④应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等；⑤乙酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。
由于乙酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。
电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条，在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。乙酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。
乙酸纤维薄膜电泳的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
(三)琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。
琼脂糖凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)具有下列优点：①琼脂含
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