第一章 遗传学实验
　　植物遗传学是遗传学的重要分支学科，遗传的分离定律和自由组合定律就是奥地利遗传学家孟德尔（G.J.Mendel）于1866年发表的《植物杂交试验》论文中提出的，谱写了遗传学的第一章。他的学说远远跨越了那个时代，因此，没有引起人们的重视和认可。1900年，荷兰遗传学家H.M.de Vries、德国植物学家C.Correns、奥地利遗传学家E Tschermak等在试验中重新发现了孟德尔的遗传定律，并给予了充分肯定，使人们对植物性状的遗传规律有了正确的认识，标志着遗传学的诞生。1906年，英国遗传学家W.Bateson把这个学科命名为“Genetics”。1914年，美国遗传学家R.A.Emerson对玉米的性状进行了研究，形成了玉米遗传学派，开创了植物遗传的新领域；在R.A.Emerson教授带领下，美国遗传学家B.McClintock详细研究了玉米减数分裂中染色体的行为，1950年提出了跳跃基因的理论和概念，1983年获得诺贝尔生理学或医学奖。在孟德尔遗传理论指导下，美国的玉米获得了丰收。20世纪50年代，N.E Borlaug通过育成矮杆抗病小麦使小麦的产量大幅度提高，被誉为“绿色革命之父”，并于1970年获得诺贝尔和平奖。我国遗传学家袁隆平教授育成的杂交水稻解决了中国乃至全世界人口的温饱问题。为了让学生深刻理解传统的遗传学理论及染色体与基因的关系，掌握植物遗传学一些基本的操作技能，我们设计了植物有丝分裂中染色体行为观察、植物减数分裂中染色体行为观察、去壁低渗法制备植物染色体玻片标本、植物染色体核型分析、植物多倍体诱发及微核检测、植物有性杂交、小麦数量性状统计和遗传率估算、农作物杂种优势测定、玉米籽粒性状分析及基因互作观察、玉米三点测交和遗传作图等10个实验。
　　Gregor Johann Mendel
　　（1822~1884奥地利遗传学家）
　　Hugo Maria de Vries
　　（1848~1935荷兰遗传学家）
　　Barbara McClintock
　　（1902~1992美国遗传学家）
　　袁隆平
　　（1930~中国遗传学家）
　　实验1 植物有丝分裂中染色体行为观察
　　【实验目的】
　　1. 观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化。
　　2. 学习和掌握植物根尖细胞压片技术。
　　【实验原理】
　　细胞分裂是生物个体生长和生命延续的基本特征。在高等植物中，有两种主要的细胞分裂方式，即有丝分裂和减数分裂。有丝分裂是植物个体生长和分化的基础，染色体是遗传物质的载体，在有丝分裂过程中，细胞核内的染色体能准确地复制，并能有规律地均匀分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞完全一样，从而可推断生物性状的遗传与染色体的准确复制和均等分配有关。
　　高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，其中根尖取材容易，操作和鉴定方便。通过对根尖的固定、染色和压片，可在显微镜下观察到大量处于有丝分裂各个时期的细胞和染色体，看到染色体的变化特点和染色体的形态特征，进行染色体计数。为了获得更多的中期染色体图像，可以采用药物处理或冷冻处理的方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期，同时还可以使染色体缩短，易于分散，便于观察研究。另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酸处理除去细胞壁，并使细胞软化，便于细胞彼此分开，有利于压片和染色。
　　秋水仙素（colchicine）是一种生物碱。冈最初从百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中提取出来而得名。分子式C22H2506N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃。易溶于水、乙醇和氯仿。味苦，有毒。在正常有丝分裂过程中形成纺锤丝，细胞两极的纺锤丝附着在染色体的着丝粒处，牵拉染色体向两极移动，从而使细胞分裂，染色体也均匀分配到两个子细胞中。而秋水仙素能破坏有丝分裂过程中纺锤丝的形成，使染色体失去向细胞两极移动的能力，导致细胞停滞在分裂中期，这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。
　　【实验材料】
　　洋葱（Allium cepa）、大蒜（Allium sativum）、蚕豆（Vicia faba）、小麦（Triticum spp.）、玉米（Zea mays）等。
　　【实验器具】
　　冰箱、恒温箱、显微镜、水浴锅、电子天平、电炉、温度计、剪刀、镊子、刀片、量筒、量杯、三角瓶、烧杯、漏斗、培养皿、酒精灯、滴瓶、载玻片、盖玻片、滤纸、标签等。
　　【实验试剂】
　　无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、45%乙醇、0.075mol/L氯化钾、0.5%醋酸洋红、0.5%苏木精液、4%铁明矾液、秋水仙素、对二氯苯、8.羟基喹啉、放线菌酮、1mol/L盐酸、乙酸钠、45%乙酸、2.5%纤维素酶、2.5%果胶酶、加拿大树胶等。
　　【实验步骤】
　　1. 根尖培养
　　1）洋葱和大蒜
　　对前一年收获的洋葱，可以首先将其鳞茎外部几层十枯的表皮除去，剪掉十枯的老根，充分洗净后置于盛清水的小烧杯口上，使根部与水接触。然后转移到25～28℃条件下培养，每天换一次水，以防污染、烂根。一般3～4d即可获得实验所需材料。待根尖长到1～1.5cm时，在9：00～10: 00剪取根尖约1cm备用。
　　如果使用当年刚采收的新洋葱鳞茎培养生根，则应设法打破它的休眠。常用的方法是用低浓度的赤霉素溶液浸泡洋葱鳞茎底盘，这样可以促使其生根。或把新鲜洋葱鳞茎在太阳下暴晒20～30d，然后再用来培养生根，也能获得很好的效果。
　　大蒜根尖的培养方法基本上与洋葱相同。对于新收获的大蒜，也需要在太阳底下暴晒20～30d。
　　2）玉米、小麦和蚕豆
　　用温水将蚕豆种子浸种2d，玉米及小麦种子浸种1d，待吸水膨胀后转移到铺有几层吸水纸的培养皿或搪瓷盘中。上面盖双层湿纱布并加入少许水，放在25～28℃条件下培养。待根尖长到2cm左有时，在9：00～10: 00或15: 00～17: 00取下根尖备用。
　　2. 预处理
　　为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应对剪下的根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的黏度，抑制和破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。
　　1）低温预处理
　　将剪取的根尖浸入盛有蒸馏水的烧杯内，置于1～4℃的冰箱中进行低温处理24h。此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种植物都适用。
　　2）药物预处理
　　（1）秋水仙素处理：用0.05%或0.1%秋水仙素溶液于室温、暗环境下处理根尖2～4h，对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的中期分裂相，且染色体收缩适中，有利于染色体结构的研究。秋水仙素属于剧毒药品，使用时戴口罩和眼镜，防止溶液溅入口中或眼内，如果发生此情况，应马上用自来水反复冲洗。
　　（2）对二氯苯处理：用饱和对二氯苯溶液于室温下处理根尖3～5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物，计数染色体制片效果更好。
　　（3）8-羟基喹啉处理：用0.002～0.004mol/L 8-羟基喹啉溶液18。C条件下处理根尖5～6h，引起细胞黏滞度的改变，导致纺锤体活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。此种处理方法对中等或长染色体的植物较合适。
　　（4）放线菌酮、8-羟基喹啉混合处理：0.007%放线菌酮和0.025%8-羟基喹啉的混合液于25 0C条件下，根尖不离体处理5h左右，可获得大量的分裂相，是最值得首选的预处理方法之一。
　　3. 固定
　　同定的目的是借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速渗入组织和细胞将其杀死，防止细胞死亡后的变化，防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构；使细胞巾的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态；使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定；使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色；防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。
　　将预处理过的根尖用蒸馏水冲洗两次（约5min），然后移人卡诸氏固定液中，在4～15℃条件下固定20～24h后，用70%乙醇冲洗2次，转入70%乙醇中，在4℃冰箱内保存，保存时间最好不超过两个月。经过较长时间保存的材料，进行观察前可以换用同定液再处理一次，效果较好。或者将预处理过的根尖放人0.075mol/L KC1溶液中低渗20min，然后在蒸馏水中冲洗2或3次（约10min）待用。
　　4. 解离
　　使分生组织细胞问的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平。解离有酸解和酶解两种方法。
　　1）酸解
　　将根尖从固定液中取出，用蒸馏水漂洗，然后放入已经在60℃水浴锅中预热的1mol/LHCl中，在60℃的恒温条件下解离10～15min，当根尖透明呈米黄色时取出，用蒸馏水冲洗2或3次。
　　酸解的优点是制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片，还可以对染色体DNA的含量进行测定。其缺点是，染色体较软，容易缠绕，不易分散。在加强预处理使染色体缩短的情况下，可获得较好的效果。另外，对小型染色体的材料效果较差。这一方法在切片、涂片上研究核及染色体时能减少细胞质着色对观察的影响。因此在细胞学研究中受到了普遍的重视。
　　酸解温度应保持在（60±0.5）℃，如果温度过低或时间过短，酸解不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；若温度过高或时间过长，会造成酸解过度，使DNA完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，游离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而造成染色浅或不均一的现象。
　　2）酶解
　　将根尖从固定液中取出，放在0.1mol/L乙酸钠中漂洗，用刀片切除根冠及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把分生组织切成2或3片），把根尖分生组织放到乙酸钠配制的2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的等量混合液中，在25～28℃条件下处理4～5h，此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上0.1mol/L乙酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再放人45%乙酸。
　　5. 后低渗
　　将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗2或3次（约10min）。酶解后的根尖放人蒸馏水中浸泡10～15min，然后再冲洗2或3次。一定要冲洗干净，否则影响染色。低渗后的根尖放人70%乙醇后备用。
　　6. 染色与压片
　　1）醋酸洋红染色制片
　　取一处理好的根尖置于载玻片中间，用吸水纸吸去多余的保存液，用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片，加一小滴醋酸洋红染色液，约5min后加盖玻片，用吸水纸放在盖玻片上面，左手按住载玻片，用右手拇指在吸水纸上对准根尖部位施加压力，或用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片即可，使材料均匀分散，细胞分离压平。压力要适当，注意不要移动盖玻片。为增强染色效果，可将载玻片在酒精灯上稍加热，但不使其沸腾，以免染料沉淀。加热不仅可以使材料软化和易于着色，而且可以破坏部分细胞质，使核和染色体有一个比较清晰的背景。如果整个细胞染色较浅，可沿盖玻片一侧，滴加少许染色液，使其慢慢渗入，放置片刻再进行加热，如此反复进行染色。
　　醋酸洋红常用于染色体的临时制片，其着色不强，分色效果也不甚佳，故不宜制作永久制片。
　　2）醋酸地衣红染色制片
　　由于地衣红很容易溶于乙醇，材料从保有液中取出后，应当充分洗净后浸入45%乙酸中再进行染色。染色时，将材料置一小试管中，加入含盐酸的2%地衣红使材料浸没，在酒精灯上加热3～5s，静置约0.5h或更长时间，取出材料置载玻片上，加一滴不含盐酸的1%醋酸地衣红染色液，如醋酸洋红法操作进行压