第一篇 基本实验操作技术
第一章 血液标本的采集
在免疫学实验中，常常需要采集人或实验动物的血液进行研究。正确采集血液标本是免疫学*基本的实验操作技术，也是获得准确、可靠实验结果的前提。血液采集技术和方法均要求保持血液标本的完整性和代表性，血液标本采集前，应根据实验目的选择合适的采血方法和合适的抗凝剂。本章主要介绍人和实验动物血液标本的采集。
实验一 人血液标本的采集
【实验目的】
掌握静脉采血法，熟悉皮肤采血法。
【血液标本的类型】
血液标本主要分为全血、血浆及血清等。
1. 全血 保留血液的全部成分，由血细胞和血浆组成。血液经抗凝处理后的全部血液称为抗凝全血，常用于免疫细胞的分离和血细胞的检查等。
2. 血浆 全血抗凝之后经离心除去血细胞后的成分，为淡黄色液体，用于血浆生理性和病理性化学成分的测定。血浆除因子Ⅳ外，含有其他全部凝血因子，特别适合于血栓与止血的检查。
3. 血清 血液离体后不经抗凝处理、自然凝固后析出的液体部分，除纤维蛋白原等凝血因子在凝血时被消耗外，其他成分与血浆基本相同，更适用于多数临床化学和临床免疫学检查。
4. 分离或浓集的细胞成分 有些临床实验特别是近年来新出现的一些医学检验项目，要求采集特定的细胞成分，如相对浓集的粒细胞、纯化的淋巴细胞、分离的单个核细胞、富集的血小板、浓集的白血病细胞等。
【实验器材】
真空采血管（普通血清管、枸橼酸钠或肝素抗凝管）、一次性使用静脉采血针、止血带、一次性专用采血针、络合碘、无菌干棉签、无菌干棉球等。
【实验方法】
血液标本的采集分为静脉采血法、皮肤毛细血管采血法和动脉采血法。动脉采血法因其风险性较高，在临床上一般很少使用。
1. 静脉采血法 当检查项目使用血量较多时通常采用静脉采血法（venipuncture for blood collection）。静脉血能准确反映全身血液的真实情况，且不易受气温和末梢循环的干扰，更具代表性。位于体表的浅静脉均可作为采血部位，通常采用肘部静脉。如果肘部静脉不明显，还可用手背静脉或内踝部静脉。婴幼儿由于肘部静脉较细和配合性差，可从股静脉或颈外静脉采血，但要准备充分，注意其风险性。
负压采血法：又称封闭式采血法（tube for blood collection），是近年来在传统的静脉采血法基础上进一步发展和完善的一种新的、简便易行的静脉采血法。其原理是封闭的试管内有定量的负压，使血液定量进入试管内（图1-1-1，图1-1-2，见文后彩图1，彩图2）。
图1-1-1 负压采血法器具
图1-1-2 负压采血法
常选择肘正中静脉或贵要静脉处采集静脉血，在穿刺点上方约6cm处系止血带，消毒，嘱被采血者握拳使静脉充盈。将一次性采血针一头胶套取下，以15°～30°角度刺入血管，见回血后，固定针柄；将双向采血针另一端针头刺入真空采血管的管盖，使血液顺着压力差流入真空采血管内。待血液停止流动后，固定针头不动，取下该真空采血管，将其余备好的真空采血管依次推入、取出，完毕松止血带，*后拔出穿刺针，用无菌干棉签按压针眼处片刻以止血。
负压采血法的优点如下所述。
（1）血样无容器之间的转移，减少了溶血现象而有效保护了血液有形成分。
（2）减少了二次污染机会，保证待检血液标本原始性状的完整性，使检验结果更为真实。
（3）如果使用血量或检查项目较多时，只要更换封闭的负压试管就可连续采血。
（4）采集的血液标本转运方便，特别适用于病房和野外流动采血，能避免对医护人员的感染和患者血液标本间的交叉污染。
2. 皮肤毛细血管采血法（skin puncture for blood collection） 皮肤毛细血管采血法主要用于需血量微小的检查项目，所得到的末梢血不单纯是毛细血管血，实际是微动脉、微静脉和毛细血管的混合血，并依采血时挤压的力度不同含有少量细胞间质和细胞内液。
采血部位：成人常用手指或耳垂采血。耳垂采血痛感较轻，操作方便，但血循环较差，受气温影响较大，检查结果不够恒定，现在不提倡使用。手指采血操作方便，可获相对较多血量，检查结果也比较恒定。世界卫生组织（WHO）曾推荐必要时可用左手环指指端内侧血做血液一般检验。婴幼儿因手指太小可用脚大趾或足跟部位采血。严重烧伤患者，应选择皮肤完整处采血。
采血器：采用特制三棱针或专用“采血针”，特别是后者有利于采血技术的质量控制，严禁用注射针头代替采血针。为避免交叉感染，必须严格实行一人一针一管（毛细吸管）。
采血方法：轻轻按摩采血部位，使局部组织自然充血，消毒皮肤。干燥后，紧捏采血部位两侧，右手持一次性消毒采血针迅速刺入，深度以2～3mm 为宜，稍加挤压血液自动流出。第1滴血液因混入组织液相对较多，常弃去不用。用微量吸管吸取血液至所要求的刻度，然后用无菌干棉球压住针刺点以止血。
【注意事项】
（1）采血前患者应保持平静，一般应在清晨时间空腹取血。
（2）静脉采血时，止血带压迫时间应小于1min。压迫时间过长（超过2min），大静脉血流受阻而使毛细血管内压上升，可能会使血管内液与组织液交流，致使分子量小于5KDa的物质溢入组织液；而且随着压迫时间延长，局部组织可能发生缺氧而引起血液成分的变化增大。
（3）负压采血时，若遇到血液不能顺畅地流入真空管，可能是因为真空管的真空度不够，更换真空管即可解决这一问题。
（4）如遇患者采血后发生晕厥，可让其迅速平卧休息片刻，一般可很快恢复。必要时可嗅芳香氨酊，针刺或指掐人中、合谷等穴位。
（5）皮肤采血应避开有炎症、化脓、冻伤等皮肤损害部位。皮肤出汗应先用干棉球擦干，以免稀释血液。采血时切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。
（6）采集血浆或血清标本时要注意防止溶血。注射器和容器必须保持干燥，静脉采血完毕应先拔针头，然后将血液徐徐注入标本容器，避免冲击力过大而致溶血。发生溶血的主要原因有容器不清洁、接触水或化学溶剂、强力振荡和分离血细胞时操作不慎等。一旦由于某种原因发生了溶血，应重新采血，不能勉强和凑合使用，以免影响检验结果。
【思考题】
1. 负压采血法的主要优点有哪些？
2. 静脉采血法和皮肤毛细血管采血法各适合于什么情况？
实验二 动物血液标本的采集
动物经免疫3～5次后，可取血测定抗体效价，若鉴定合格，应在末次免疫后5～7d及时采血；若抗体效价不理想，可追加免疫1～2次后再行采血。
【实验目的】
熟悉免疫学试验中常用动物的血液采集方法。
常用实验动物：小鼠、大鼠、家兔和犬。
【实验器材】
1. 器材 兔箱、兔固定台、犬固定台、鼠固定板、剪刀、手术刀、注射器、玻璃毛细管、血色素吸管、止血带等。
2. 试剂 1%肝素生理盐水溶液、饱和草酸钾溶液、3.8%的枸橼酸钠溶液、生理盐水。
【实验方法】
实验动物的采血方法较多，按采血部位不同可分为穿刺采血法（含剪、割法）、断头采血法、心脏采血法、颈动（静）脉采血法、腹主动脉采血法、股动脉采血法、耳静脉采血法、尾静脉采血法等。
1. 大鼠与小鼠的采血方法
（1）尾静脉采血法：适用于所需采血量很少时。固定动物并露出鼠尾，将尾部浸入45～50℃温水中数分钟，使尾静脉充血，擦干，再用酒精棉球消毒。剪掉尾尖（0.2～0.3cm），拭去第一滴血。然后用血色素吸管定量吸取尾血。采血完毕用干棉球压迫止血。亦可不剪尾，用7～8号注射针头连上注射器直接刺入尾静脉采血（图1-1-3）。若反复采血，可由鼠尾远心端向近心端逐步穿刺（或剪断尾部）。
（2）眼眶静脉丛采血法：当需血量中等而又要避免动物死亡时采用。左手拇指及示指紧紧握住大鼠或小鼠颈部，压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血，但用力要恰当，防止动物窒息死亡。右手持7号针头（连接1ml的注射器）或者玻璃毛细管，从右（左）眼内眦部以45°角刺入（图1-1-4）。大鼠刺入深度为4～5mm，小鼠为2～3mm，当刺入后感到有阻力时停止推进，同时退针0.1～0.5mm，边抽边退。采完后拨出针头或毛细管，同时除去加于颈部的压力，用干棉球压迫止血。小鼠一次可采血0.2～0.3ml，大鼠一次可采血0.5～1ml。
图1-1-3 鼠尾静脉采血
图1-1-4 鼠眼眶静脉丛采血
（3）断头采血法：当需血量较大而又不需继续保存动物生命时采用。该法是用利器（术剪或刀片）断离头颈部一次性采血，适用于大鼠和小鼠。采血时操作者左手拇、示指握住鼠颈部，头部朝下，用利剪在鼠颈头间1/2处剪断，让血液自由滴入容器中，小鼠可采血1ml左右，大鼠可采血10ml左右。断头采血法所获血液中混有少量组织液，有时还混有断毛，极易被污染，故采血时应注意防止污染。
2. 家兔采血方法
（1）耳缘静脉采血法：为*常用的取血方法之一，可多次反复取血。将家兔固定于兔箱中，选静脉较粗而清晰处，拔掉拟采血耳缘部细毛，用手指轻弹兔耳或电灯照射兔耳，使耳部血管充分充盈，然后消毒，用5号半针头沿耳缘静脉远端（末梢端）刺入血管（静脉采血时应逆血流方向进针），取血后酒精棉球压迫止血，此法一般可采血5～10ml。也可左手压迫耳根，用针头刺破静脉或以刀片在血管上切一小口，让血液自然流出。采取抗凝血时应在耳缘切口处涂20%枸橼酸纳液，采血完毕用干棉球压迫止血。
（2）颈动脉采血法：常用的取血方法之一，适用于家兔、绵羊和山羊等。以家兔为例，在家兔颈外侧做皮肤切口，分离颈总动脉，插入动脉插管，将血液引入无菌的玻璃器皿。放血不宜过快，否则易致动物死亡，故应在放血总量近一半时，将动脉夹住片刻后再继续放血，这样获得的血量可明显增多，颈动脉采血一般可获血50ml，*多可获70～80ml。
（3）耳动脉采血法：耳部采血也可选耳中央动脉，兔耳中央有一条或两条较粗、颜色较鲜红的动脉，刺入方向应朝近心端（图1-1-5，彩图3）。由于兔耳中央动脉在受刺激时有痉挛反应，因此刺入血管后稍等片刻或在痉挛前迅速抽血。取血针头应稍大一些，一般用6号针头。耳动脉采血部位应从中央动脉末端开始，不要在近耳根部进针，因近耳根部组织较厚，血管不清晰。
（4）心脏穿刺采血法：多用于家兔、豚鼠、大鼠和鸡等动物的采血（小动物因心脏搏动很快、心腔小、位置较难固定而较少使用）。将家兔仰卧位固定在兔台上或由助手捉持，在左胸第2～4肋部剪毛，常规消毒。采血时，先用指尖于第3～4肋胸骨左缘探明心脏搏动*明显之处进针，针头宜长些（采用6号针头）（图1-1-6，彩图4）。刺入胸腔后，仔细感觉针尖随心脏搏动在动，如将注射器抽成负压，血液可自动流入注射器。采血完毕迅速将针头拔出，这样心肌上的穿刺孔较易闭合，针眼处用酒精棉球压迫止血。1只家兔一次可采血20～30ml。心脏采血时动作应迅速，缩短留针时间以防止血液凝固，若针头已刺入心腔但又抽不出血时，应将针头稍微轴向转动一下或稍后退一点，切不可使针头在心脏内横向摆动。
图1-1-5 耳缘静脉采血
图1-1-6 心脏采血
（5）股动脉采血法：将家兔仰卧于实验台上，伸展后肢固定，暴露出腹股沟三角动脉搏动部位，剪毛，消毒，使用5号半针头的注射器，以血管搏动为指标，将针头直接刺入血管内。若已刺入动脉血管，即有鲜红色血液流入注射器。抽血完毕迅速拔出针头，用干棉球压迫止血几分钟。
3. 犬的采血方法
（1）后肢外侧小隐静脉和前肢皮下头静脉采血：本法*常用，且方便。抽血前，将犬固定在犬固定台上或使犬侧卧，剪去抽血部位的毛，常规消毒，一人用力压迫静脉近心端或用
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