实验一 毒理学实验的基础知识与综合技能
　　毒理学作为一门实验科学，主要研究外源化学物对机体的损害作用及其机制。毒理学实验根据不同的实验目的，采用一定的实验方法对外源化学物的毒性进行鉴定或安全性评价。毒理学实验常采用体内或体外实验模型来观察受试外源化学物对机体的损害作用，从而发现其有害作用的剂量-反应关系，获得受试物的各种毒性参数，确定受试物毒性作用的靶器官，阐明受试物毒性作用特点，为进一步研究其毒性作用机制和防治措施提供理论依据。
　　一、案例与问题
　　（一）案例
　　修正液，俗称“涂改液”或“消字灵”，被广泛用于中小学生写字错误后的修改。为了探索修正液对人体健康有无危害，某电视台记者在某处设计一项动物实验，即3只实验小白鼠被分入高、中、低剂量组，在3个相同带孔玻璃容器内分别倒入20 ml、10 ml和5 ml修正液。为了研究修正液对小白鼠的直接和间接毒性，记者在中、低剂量组容器内先放6个医用棉球，然后滴入相应容积修正液，但高剂量组溶剂瓶内未放棉球而直接滴入修正液，小白鼠被同时放入玻璃容器后开始计时和观察小鼠精神、活动和死亡情况。结果显示，高、中和低剂量组小白鼠分别于2分钟、3分钟和5分钟左右死亡。根据以上实验结果，记者得出修正液对中小学生健康有害的结论。
　　（二）问题
　　1.从毒理学专业角度，请你找出该动物实验设计与流程的不足之处。
　　2.该动物实验结果能否直接外推到人？动物实验结果外推到人有哪些不确定因素？
　　3.毒理学实验的基本原则、目的和特点分别是什么？
　　4.如何获得正确可靠的动物实验结果？
　　5.实验人员应该具备哪些动物实验基本操作技术？
　　二、毒理学实验概述
　　（一）毒理学实验的基本原则
　　1.外源化学物在实验动物中产生的毒性作用可外推至人 由于外源化学物在体内生物转化、代谢的方式和程度受化学物的理化性质、机体的体重及易感性的影响，外源化学物在不同物种动物体内吸收、分布、生物转化和代谢有明显不同。在进行外推时，必须尽可能全面地收集和了解外源化学物对受试动物的毒性作用和特点，需考虑外源化学物在不同物种动物体内的生物转化和代谢方式与人的相似性及适当的安全系数。
　　2.毒理学研究中所选用的剂量高于人实际接触剂量 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的方法。进行外源化学物的安全性评价和风险评估时，无论采用实验动物资料还是人群流行病学资料都存在高剂量向低剂量外推的过程。一般情况下，随着外源化学物在实验动物体内暴露剂量的增加，群体中效应发生率也逐渐增加。但高剂量的效应和低剂量的效应不一定相同。即使高剂量和低剂量的效应性质相同，用高剂量的剂量-效应关系来推测低剂量的剂量-效应关系也存在着很大差别。低水平、长期、慢性接触是各种外源化学物对人体影响的基本方式。随着毒理学实验方法和技术的快速发展，毒理学实验将由高剂量测试向低剂量测试发展，这就需要用灵敏的指标才能观察到亚临床毒效应，而灵敏的指标必须在多终点生物学效应研究的基础上才能确定。
　　3.实验动物暴露途径尽可能与人相似 为使实验结果更具有代表性和可重复性，常采用成年健康雄性和未孕雌性实验动物。幼年和老年动物的生理状态对外源化学物的敏感性不同，幼年动物可能更敏感，老年动物可能不敏感或反应较迟钝，不能反映真实情况。幼年和老年动物、妊娠雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。外源化学物经不同途径暴露于实验动物，所表现出来的毒性作用和方式不同。毒理学实验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人暴露的方式。
　　4.准确性和可重现性 实验动物存在个体差异，选择健康成年实验动物能使实验结果具有代表性和可重复性，减少实验误差。毒理学实验要严格控制实验条件、规范实验操作、控制可能影响毒效应的因素，提高测试仪器和方法的灵敏度，以确保实验结果的准确性和可重现性。
　　（二）毒理学实验的目的
　　1.了解受试物毒性作用性质和特点 毒理学评价的目的是评价外源化学物的安全性和危险性。急性毒性试验通过对每个受试实验动物的全面观察和详细记录，评价化学物质对机体的毒性大小，毒效应的特征和剂量-反应（效应）关系，确定毒性作用的性质，为进一步的亚慢性、慢性毒性研究和其他毒理学试验的剂量选择和效应观察提供依据。
　　2.确定剂量-反应关系 剂量-反应关系研究是毒理学评价和安全性评价的基础。所有化学物质的毒性都与剂量有关，通过对受试物不同有害作用的剂量-反应研究，可得到多种毒性参数和剂量-反应曲线的斜率。急性毒性试验可确定毒性上限参数半数致死剂量（LD50），也可得到最小致死剂量（LD01）和最大非致死剂量（LD0）。急性、亚慢性和慢性毒性试验也可获得观察到有害作用最小剂量（lowest observed adverse effect level，LOAEL）和未观察到有害作用剂量（最小致死剂量（LD01）和最大非致死剂量（LD0）。急性、亚慢性和慢性毒性试验也可获得观察到有害作用最小剂量（lowest observed adverse effect level，LOAEL）和未观察到有害作用剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）。致畸实验也可得到LOAEL和NOAEL。致突变和致癌实验尽管认为是无阈值的，也可得到观察的LOAEL和NOAEL。只有在一定剂量范围内剂量-反应关系曲线的斜率是可以确定的，如果超出这个范围即无法确定。
　　3.确定毒性作用靶器官 毒理学试验观察染毒动物中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间。对于死亡动物和观察期结束处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察如发现异常的组织或脏器，应做病理组织学检查。根据中毒表现和特点大致确定靶器官，描述毒性作用性质和特点。
　　4.确定损害作用的可逆性 毒理学试验一旦确定存在有害作用，就应该研究停止暴露或减低暴露水平后毒害作用是否可以消失或减轻，以及受损组织、器官的功能是否可以恢复。致突变、致癌和致畸作用一旦出现是不可逆的。毒性的可逆性关系到对人的危害的评价。如器官有害作用可逆，给患者治疗时就可以相应提高药物剂量以达到治疗目的。
　　5.探讨毒性作用机制 传统毒理学主要采用动物模型进行毒性测试，通常以功能和形态学指标反映实验终点。机制毒理学采用分子生物学技术研究外源化学物毒性作用机制和调控作用，寻找能够在不同物种间进行毒性比较的生物学标志，确定外源化学物毒性作用靶点，据此研究诊断治疗药物，为化学物中毒的诊断和防治提供理论依据。
　　6.对毒物进行科学管理 在了解外源化学物的毒性和作用机制基础上，根据描述和机制毒理学的研究资料，制定卫生标准。按照安全性评价程序对外源化学物、药品、食品进行安全性评价，以使其能够安全进入市场，达到保护人体健康的目的。为协助政府部门制定相关法规，提出科学决策提供理论依据。
　　毒理学研究还可用于其他目的和要求，如毒性作用敏感检测指标和生物学标志、受试物毒物动力学和代谢研究、中毒的解救措施等。
　　（三）毒理学实验的特点
　　外源化学物毒性作用受到许多因素的影响，生物体结构和功能十分复杂。动物毒理学实验资料外推到人时，应注意以下特点。
　　1.实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同 毒理学实验通常采用两种或两种以上的实验动物，应尽可能地选择与人对毒物反应相似的动物和暴露途径，但有时各物种之间存在很大差别。动物毒理学实验资料外推到人要充分考虑物种间的差异。
　　2.实验动物暴露剂量高于人的暴露剂量 为寻找毒性作用靶器官，且能够在相对少数动物身上得到剂量-反应（效应）关系，往往要选用较大的暴露剂量，这一剂量比人群实际暴露水平大得多。有些化学物在高剂量效应和低剂量效应不一致，甚至完全相反。高剂量效应向低剂量效应外推时存在不确定性。
　　3.实验动物外推到人的不确定性 毒理学实验使用动物数量有限，有些外源化学物的毒性作用比较低，在少数的动物实验过程中很难发现。化学物在实际应用过程中接触人群很大，存在少量实验动物到大人群外推的不确定性。
　　4.毒理学实验的复杂性 不同物种实验动物在解剖、生理、遗传学和代谢过程存在差异，同一品系不同个体间存在代谢差异，实验动物所处的健康状态、年龄、性别、营养状况都存在着差异，造成外源化学物在实验动物机体毒性作用性质和特点的复杂性。
　　三、毒理学实验规范与职业道德
　　随着化学品数量不断增加，给毒理学带来了严重的挑战。毒理学应扩大毒性研究的范围。从事外源化学物毒性研究时，其鉴定的质量应当符合科学实验的要求，确保获得实验资料的完整性、客观性、可靠性、准确性和可重复性，以便在不同国家和人群中具有可比性。为了达到以上要求，必须使从事这些实验的实验室具有良好实验室规范。
　　（一）良好实验室规范
　　良好实验室规范（good laboratory practice，GLP）是指对实验室条件、实验室管理、实验研究计划制定、实施和签发化学品毒性鉴定书等各个方面都做了具体要求和严格规定。
　　GLP的基本精神是全面的质量保证。GLP规范中特别强调质量保证在于从客观上保证实验的可信度。在毒理学实验中对化学品或产品进行安全性评价必须遵循GLP的原则，这是国家法规要求的。在有些毒理学研究中虽然没有强制性地要求按照GLP的规定，但是如果按照GLP规定操作，能够为实验的顺利进行和实验结果的可靠性提供质量保证。
　　（二）动物实验的职业道德
　　实验动物（laboratory animal）包括所有脱离自然环境而用于教学和科学研究试验的脊椎动物。对于外源化学物毒性研究和新药的开发，毒理学动物实验是必不可少的。所有研究人员要尊重生命，善待实验动物。早在18世纪就出版了有关动物的伦理学书籍和文章，先后成立了动物保护组织，制定了《禁止虐待动物法》 《科学实验动物法》 。实验动物伦理是指人在动物实验过程中所应遵循的对待实验动物的道德准则。动物伦理包括动物福利和动物权利（解放）。目前，动物实验涉及的动物伦理问题主要集中在动物福利问题上。实验动物福利是指在饲养管理和使用实验动物过程中，要采取有效措施，使实验动物免遭不必要的伤害、不适、饥渴、恐慌、折磨、疼痛和疾病，保证动物能够实现自然行为，受到良好的管理和照料，动物个体处于一种康乐状态下。中国《实验动物管理条例》明文规定，对实验动物必须爱护不得戏弄或虐待。对用于教学和科学研究试验的实验动物，必须负有道义上的责任。应在使用实验动物过程中对实验动物给予人道主义的管理和处理，使其痛苦和不适感减少到最低限度，避免不必要地使用实验动物。
　　使用实验动物进行任何科学研究时都必须符合“3R”原则，即替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement）。
　　1.替代 是指使用没有知觉的实验材料代替活体动物，或使用低等动物替代高等动物进行试验，并获得相同实验效果的科学方法。实验动物的替代物范围很广，所有能代替整体实验动物进行试验的化学物质、生物材料、动植物细胞、组织、器官，计算机模拟程序等都属于替代物，也包括低等动、植物（如细菌、蠕虫、昆虫等）。小动物替代大动物（如转基因小鼠替代猴，进行脊髓灰质炎减毒活疫苗的生物活性检测等），同时也包括方法和技术的替代（如用分子生物学方法，代替动物实验来鉴定致癌物或遗传毒性的遗传毒理学体外实验方法等）。
　　2.减少 是指在科学研究中，在动物实验时，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多的试验数据的科学方法。