第一篇 常用仪器及其使用方法
本篇主要介绍人体形态学实验的常用仪器和使用方法，包括多种显微镜的结构和使用，光镜和电镜的常用制片方法，组织化学、免疫组织化学和原位杂交技术及组织细胞培养技术等。
第一章 显微镜的结构和使用
显微镜是一种精密的光学仪器，已有300多年的发展史。自从有了显微镜，人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。目前，不仅有能放大千余倍的光学显微镜，而且有放大几十万倍的电子显微镜。本章主要介绍医学常用显微镜的基本结构和使用方法。
第一节 普通光学显微镜的结构和使用方法
【实验目的】
掌握普通光学显微镜的低倍镜、高倍镜和油镜使用方法；了解普通光学显微镜的基本结构及其保护要点。
【实验原理】
普通光学显微镜是一种精密的光学仪器，是生物医学研究不可缺少的工具。显微镜的镜头由一套透镜组成，普通光学显微镜通常能将物体放大1500～2000倍。显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜的数值孔径决定的，缩短使用的光波波长或增加数值孔径可以提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
【实验方法】
一、普通光学显微镜的结构
显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图1-1-1-1）。
（一）显微镜的机械装置
显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头，固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器与调焦装置组成。
图1-1-1-1 光学显微镜的结构
1.镜座和镜臂 镜座的作用是支撑整个显微镜，装有反光镜，有的还装有照明光源。镜臂的作用是支撑镜筒和载物台，分固定式和活动式两种。
2.载物台（又称工作台、镜台） 载物台作用是安放载玻片，形状有圆形和方形两种。中心有一个通光孔，通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔。分为固定式与移动式两种。有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺，一般读数为0.1cm，游标尺可用来测定标本的大小，也可用来对被检部分做标记。
3.镜筒 镜筒上端放置目镜，下端连接物镜转换器。分为固定式和可调节式两种。机械筒长（从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长）不能变更的叫作固定式镜筒，能变更的叫作调节式镜筒，新式显微镜大多采用固定式镜筒。安装目镜的镜筒，有单筒和双筒两种。单筒又可分为直立式和倾斜式两种，双筒则都是倾斜式的。其中双筒显微镜，两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳。双筒之间的距离可以调节，而且其中有一个目镜有屈光度调节（即视力调节）装置，便于两眼视力不同的观察者使用。
4.物镜转换器 物镜转换器固定在镜筒下端，有3～4个物镜螺旋口，物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时，应用手指捏住旋转碟旋转，不要用手推动物镜，因时间长容易使光轴歪斜，使成像质量变差。
5.调焦装置 显微镜上装有粗准焦螺旋和细准焦螺旋。有的显微镜粗准焦螺旋与装在同一轴上，大螺旋为粗准焦螺旋，小螺旋为细准焦螺旋；有的则分开安置，位于镜臂的上端较大的一对螺旋为是粗准焦螺旋，其转动一周，镜筒上升或下降10mm。位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋，其转动一周，镜筒升降值为0.1mm，细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm。
（二）显微镜的光学系统
显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反光镜和聚光器四个部件。广义地说也包括照明光源、滤光器、盖玻片和载玻片等。
1.物镜 物镜是决定显微镜性能的*重要部件，安装在物镜转换器上，接近被观察的物体，故叫作物镜或接物镜。
（1）物镜的分类：物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜；其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜（常用放大倍数为90～100倍）。根据放大倍数的不同可分为低倍物镜（10倍以下）、中倍物镜（20倍左右）高倍物镜（40～65倍）。根据像差矫正情况，分为消色差物镜（常用，能矫正光谱中两种色光的色差的物镜）和复色差物镜（能矫正光谱中三种色光的色差的物镜）。
（2）物镜的主要参数：物镜主要参数包括：放大倍数、数值孔径和工作距离。①放大倍数是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10000倍。显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。②数值孔径也叫镜口率，简写NA或A，是物镜和聚光器的主要参数，与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0.05～0.95，油浸物镜（香柏油）的数值孔径为1.25。③工作距离是指当所观察的标本*清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关，物镜的焦距越长，放大倍数越低，其工作距离越长。例：10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17，其中10为物镜的放大倍数；0.25为数值孔径；160为镜筒长度（单位：mm）；0.17为盖玻片的标准厚度（单位：mm）。10倍物镜有效工作距离为6.5mm，40倍物镜有效工作距离为0.48mm。
（3）物镜的作用是将标本作第一次放大，它是决定显微镜性能的*重要的部件。显微镜不能无限放大图像，过分放大会导致图像不清晰，它受分辨率（resolution power）的限制。分辨率的大小是用分辨距离（所能分辨开的两个物点间的*小距离）的数值来表示的。在明视距离（25cm）之处，正常人眼所能看清相距0.073mm的两个物点，这个0.073mm的数值，即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小，即表示它的分辨率越高，也就是表示它的性能越好。显微镜的分辨率的大小由物镜的分辨率来决定的，而物镜的分辨率又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。当用普通的中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为R=0.61λ/NA。式中R——物镜的分辨距离，单位nm；λ——照明光线波长单位：nm；NA——物镜的数值孔径。例如油浸物镜的数值孔径为1.25，可见光波长范围为400～700nm，取其平均波长550nm，则d=270nm，约等于照明光线波长一半。一般地，用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm。
2.目镜
（1）目镜的结构：通常目镜由上下两组透镜组成，上面的透镜叫作接目透镜，下面的透镜叫作会聚透镜或场镜。上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑（它的大小决定了视场的大小），因为标本正好在光阑面上成像，可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针，用来指示某个特点的目标。也可在其上面放置目镜测微尺，用来测量所观察标本的大小。目镜的长度越短，放大倍数越大（因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比）。
（2）目镜的作用：是将已被物镜放大的，分辨清晰的实像进一步放大，达到人眼能容易分辨清楚的程度。常用目镜的放大倍数为5～16倍。
（3）目镜与物镜的关系：物镜已经分辨清楚的细微结构，假如没有经过目镜的再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也还是看不清楚，所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点，但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离，还是无法看清。所以，目镜和物镜即相互联系，又彼此制约。
3.聚光器 聚光器也叫集光器。位于标本下方的聚光器支架上。它主要由聚光镜和可变光阑组成。其中，聚光镜可分为明视场聚光镜（普通显微镜配置）和暗视场聚光镜。
（1）光镜的主要参数：数值孔径（NA）是聚光镜的主要参数，*大数值孔径一般是1.2～1.4，数值孔径有一定的可变范围，通常刻在上方透镜边框上的数字是代表*大的数值孔径，通过调节下部可变光阑的开放程度，可得到此数字以下的各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。
（2）聚光镜的作用：聚光镜的作用相当于凸透镜，起会聚光线的作用，以增强标本的照明。一般地把聚光镜的聚光焦点设计在它上端透镜平面上方约1.25mm处。
（3）可变光阑：可变光阑也叫光圈，位于聚光镜的下方，由十几张金属薄片组成，中心部分形成圆孔。其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。可变光阑开得越大，数值孔径越大（观察完毕后，应将光圈调至*大）。在可变光阑下面，还有一个圆形的滤光片托架。
4.反光镜 反光镜是一个可以随意转动的双面镜，直径为50mm，一面为平面，一面为凹面，其作用是将从任何方向射来的光线经通光孔反射上来。平面镜反射光线的能力较弱，是在光线较强时使用，凹面镜反射光线的能力较强，是在光线较弱时使用。反光镜的作用是使由光源发出的光线或天然光射向聚光器。当用聚光器时一般用平面镜，不用时用凹面镜；当光线强时用平面镜，弱时用凹面镜。观察完毕后，应将反光镜垂直放置。
5.照明光源 显微镜的照明可以用天然光源或人工光源。天然光源，光线来自天空，*好是由白云反射来的。人工光源，对人工光源的基本要求：有足够的发光强度；光源发热不能过多。常用的人工光源：显微镜灯；日光灯。
6.滤光器 安装在光源和聚光器之间。作用是让所选择的某一波段的光线通过，而吸收掉其他的光线，即为了改变光线的光谱成分或削弱光的强度。分为两大类：滤光片和液体滤光器。
7.盖玻片和载玻片 盖玻片和载玻片的表面应相当平坦，无气泡，无划痕。*好选用无色，透明度好的，使用前应洗净。盖玻片的标准厚度是0.17±0.02mm，如不用盖玻片或盖玻片厚度不合适，都会影响成像质量。载玻片的标准厚度是1.1±0.04mm，一般可用范围是1～1.2mm，若太厚会影响聚光器效能，太薄则容易破裂。
二、显微镜的使用
显微镜观察标本切片的基本程序依次是显微镜的准备、标本的肉眼观察、低倍镜、高倍镜和油镜观察。这样才能有效、快速完成实验。
1.显微镜的准备
（1）取镜和放置：显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左一手托住镜座，将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边5～10cm为宜，便于坐着操作。右侧放记录本或绘图纸。
（2）对光：用拇指和中指移动旋转器（切忌手持物镜移动），使低倍镜对准镜台的通光孔（当转动听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心）。打开光圈，上升集光器，并将反光镜转向光源（电光源不用），直到视野内的光线均匀明亮为止。
2.标本的肉眼观察 主要观察切片标本的大小、外形、在切片上的位置以及大标本上要观察的部位，以便于镜下观察。
3.低倍镜观察
（1）放置玻片标本：取一玻片标本放在镜台上，一定使有盖玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中。
（2）调节焦距：以左手按逆时针方向转动粗调节器，使物镜距标本片约5mm处。一定要从侧面观察以免造成镜头或标本片的损坏。
单筒显微镜，两眼同时睁开，用左眼在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，直到视野中出现清晰的物像为止。如果物象不在视野中心，可调节推片器将其调到中心（注意移动玻片的方向与视野物象移动的方向是相反的）。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节，如果在调节焦距时，未见到物象，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可心急而盲目地调整。
双筒显微镜，先调两个目镜筒之间的距离（瞳距），双眼看到一个明亮的圆形视野即可。调焦时，先闭左眼，转动调焦轮调节右眼焦距清楚；闭右眼，转动左目镜的镜头至焦距清楚，此时，双眼的焦距就一致了。
4.高倍镜观察 在低倍镜观察的基础上直接转换高倍镜到通光孔，除个别维修配置的物
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