第一章 定量分析技术
　　生命科学中的许多问题，要通过对物质含量的测定来分析和探索，生物大分子的分离纯化过程中，也经常要对其含量进行分析和测定。生物化学与分子生物学中常用的定量分析方法主要有滴定分析法、分光光度法、荧光分析法、酶活测定法等。层析、电泳、分子杂交等技术，既可用于分离分析，又可用于含量测定，拟在其他章节介绍。放射性同位素技术主要用于分子杂交，免疫学技术主要用于免疫电泳和酶联显色，将在有关章节概要介绍其中与生物化学及分子生物学关系密切的部分内容。
　　第一节 滴定分析法
　　滴定分析法只需要简单的玻璃器皿，或简单的仪器，可较准确地测定溶液中常量成分的含量，在化学化工领域，及食品和药品的理化检验中应用较广。
　　一、基本原理
　　(一) 滴定分析法的概念
　　“滴定”(titration)是将已知准确浓度的溶液——标准溶液通过滴定管滴加到待测溶液中的过程。待“滴定”进行到化学反应按计量关系完全作用为止，然后根据所用标准溶液的浓度和体积计算出待测物质含量的分析方法称为滴定分析法。因为这类方法是以测量标准溶液的容积为基础的方法，故也称为“容量分析法”(volumetri canalysis)。滴定分析法具有快速准确，操作简便，仪器要求低的特点，相对误差一般在0.2%以下。
　　滴定分析法适合于测定溶液中常量成分的含量，在食品和药品的理化检验，及化学化工领域应用较广。灵敏度更高的紫外可见分光光度法、荧光分析法、气相色谱和高效液相色谱法适合于测定溶液中微量成分的含量。一般来说，微量分析法相对误差较大。若将待测成分含量较高的溶液高度稀释，再用相对误差较大的微量成分分析法测定其含量，乘以稀释倍数，会扩大误差，使测定结果不准确。选择测定方法的原则是，常量成分的测定用常量分析法，微量成分的测定用微量分析法。因此，滴定分析法在工业领域应用较广。
　　当化学反应按计量关系完全作用，即滴入溶液物质的量与待测定组分物质的量恰好符合化学反应式所表示的化学计量关系，称为反应到达了化学计量点(stoichiometric point)。适合于滴定分析的化学反应必须具备以下三个条件：①待测物质与标准溶液之间的反应要有严格的化学计量关系，反应定量完成的程度要达到99.9%以上，这是定量计算的基础；②反应必须迅速完成，或通过加热、使用催化剂等措施可以迅速完成；③必须有适宜的指示剂或其他简便可靠的方法确定终点。
　　(二) 生物化学与分子生物学中常用的滴定法
　　根据化学反应类型的不同，滴定分析法可分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。在生物化学中，使用较多的是酸碱滴定法和氧化还原滴定法。
　　1. 酸碱滴定法
　　酸碱滴定法是利用酸碱中和反应的一种容量分析法。一般可按两种方式进行。
　　(1) 直接法利用酸或碱的标准溶液直接滴定被测的碱性物质或酸性物质。
　　(2) 间接法有些物质由于某些原因不能用酸或碱直接滴定，但可以用间接法测定。例如，测定硫酸铵的含氮量时，可以在硫酸铵溶液中加入浓氢氧化钠溶液，加热，使生成氨，然后用过量的一定体积的标准酸溶液吸收生成的氨，再用标准溶液滴定剩余未作用的标准酸溶液，就可以根据化学计量关系求出氮的含量。
　　由于一般酸碱反应进行时，无外观变化，因此必须设法确定化学计量点。最常用的方法是在被滴定的溶液中加入指示剂，根据指示剂颜色变化来指示化学计量点。
　　2. 氧化还原滴定法
　　氧化还原滴定法，是以氧化还原反应为基础的容量分析方法。
　　因为多数元素具有不同的氧化态，所以选用合适的氧化剂作为滴定剂，可以测定许多还原性物质；也可以用合适的还原剂测定许多氧化性物质。
　　依照所用氧化剂或还原剂的不同，常见的氧化还原滴定法分为如下数种。
　　(1) 重铬酸钾法用重铬酸钾作为氧化剂，测定还原性物质。重铬酸钾是强氧化剂，在酸性溶液中，可以获得6个电子，本身还原为正三价铬离子：
　　(2) 高锰酸钾法高锰酸钾是一种强氧化剂，在酸性溶液中获得5个电子被还原为正二价锰离子：
　　在中性或微酸性溶液中，高锰酸钾，可以获得3个电子还原为二氧化锰：
　　在氧化还原滴定中，一般采用酸性溶液中的反应。
　　(3) 碘量法用碘作为氧化剂，一个碘原子可以获得1个电子形成碘离子：
　　在氧化还原滴定中，硫酸亚铁常作为还原剂与高锰酸钾或重铬酸钾配合使用。硫代硫酸钠常与碘配合使用。亚铁离子氧化成高铁离子。硫代硫酸钠氧化为连四硫酸钠：
　　碘和硫代硫酸钠的反应是碘量法的基本反应：
　　因为许多强的还原剂容易被空气中的氧氧化，所以氧化还原滴定法中氧化剂应用较多。氧化还原滴定中所用的氧化剂都是比较稳定的。在分析过程中，氧化剂的选择要依分析的对象和任务而定。作为分析反应主要应考虑到反应能否进行、反应进行完全的程度、反应的速度以及如何提高反应的选择性等因素。
　　(三) 滴定方式
　　根据滴定方式可将滴定分析法分为以下几种。
　　(1) 直接滴定法 所用化学反应能满足滴定要求时，可直接用标准溶液滴定被测物质，称为直接滴定法，如用盐酸标准溶液滴定氢氧化钠试样溶液等。
　　(2) 返滴定法 又称剩余滴定法或回滴定法。若反应速度较慢或者反应物是固体，滴定剂加入样品后反应无法在瞬时定量完成，可先加入一定量的过量标准溶液，待反应定量完成后用另外一种标准溶液作为滴定剂滴定剩余的标准溶液。如固体碳酸钙的测定可先加入一定量的过量盐酸标准溶液至试样中，加热使样品完全溶解，冷却后再用氢氧化钠标准溶液返滴定剩余的盐酸。
　　(3) 置换滴定法 对于不按确定化学计量关系反应(如伴有副反应)的物质有时可加入适当试剂与待测物质反应，使其被定量地置换成另外一种可直接滴定的物质，再用标准溶液滴定此生成物。如硫代硫酸钠不能直接滴定重铬酸钾或其他强氧化剂，因为强氧化剂能将S2O23-氧化成S4O26-和SO24-的混合物，化学计量关系不确定，故无法采用直接滴定法测定。若在酸性重铬酸钾溶液中加入过量KI，使K2Cr2O7定量反应生成I2，再用Na2S2O3标准溶液直接滴定，可定量测定重铬酸钾及其他氧化剂。
　　(4) 间接滴定法 有时还应用其他化学反应间接测定待测物，如对Ca2+的测定可通过生成CaC2O4沉淀的反应，将沉淀过滤洗净后溶于酸，用KMnO4标准溶液滴定草酸而间接测定Ca2+的含量。
　　二、标准溶液
　　(一) 标准溶液与基准物质
　　在滴定分析中，不论采用何种滴定方式，都离不开标准溶液。标准溶液的配制分为直接法和间接法。
　　1. 直接法
　　标准溶液的直接配制需要使用基准物质，即能用来直接配制标准溶液的物质。基准物质应该符合下列条件：
　　① 试剂组成和化学式完全相符；
　　② 试剂的纯度一般应在99.9%以上，且稳定，不发生副反应；
　　③ 试剂最好有较大的摩尔质量，以便减少称量误差。
　　用于配制标准溶液的常用基准物质有重铬酸钾、氯化钠、硝酸银等。
　　配制方法是准确称取一定量的基准物质，用一定溶剂溶解后定量转移到容量瓶中，稀释至刻度；根据称取的基准物质的质量和容量瓶的容积，即可算出该标准溶液的准确浓度。
　　2. 间接法
　　当无法找到基准物质时需先配制成大致浓度的溶液，再利用该物质与基准物质或者另外一种已知浓度的溶液的反应测定出该溶液的准确浓度。
　　用配制溶液滴定基准物质计算其准确浓度的方法称为标定(standardization)。大多数标准溶液是通过标定确定其准确浓度的。邻苯二甲酸氢钾、无水碳酸钠、重铬酸钾、氧化锌等可制得基准物质用于标定标准溶液。
　　经标定的标准液，其浓度大致等于预设浓度即可。如预设浓度为0.10mol/L，标定结果为0.08~0.12mol/L任一数据均可。后续用实际标定的浓度进行计算，可得正确结果，不必将标准液浓度刻意调整为0.10mol/L。
　　用另外一种标准溶液滴定一定量的配制溶液或用该溶液滴定另外一种标准溶液确定其浓度的方法称为比较法。比较法一般不及标定法应用得普遍。
　　(二) 标准溶液浓度的表示方法
　　1. 物质的量浓度
　　设VB为溶液的体积(L或mL)，nB为溶液中溶质B物质的量(mol或mmol)，CB表示溶质B物质的量浓度(mol/L或mmol/mL)，则CB可由下式求得：
　　物质的量使用的单位摩尔(mol)或毫摩尔(mmol)是我国法定使用的国际单位制(SI)中的基本单位。
　　若物质B的质量为mB(g)，则CB、溶液的体积VB和摩尔质量MB间的关系为
　　2. 滴定度
　　在生产实践中经常需要滴定分析大批试样中某组分的含量，为了计算方便，常用滴定度(titer)表示标准溶液的浓度。
　　滴定度有以下两种表示方法：
　　① 以每毫升标准溶液中所含溶质的质量表示。例如，THCl=0.00364g/mL，表示每毫升HCl溶液中含HCl的质量为0.00364g。
　　② 以每毫升标准溶液所能滴定的被测物质的质量表示。例如，TNaOH/HCl=0？。00364g/mL，表示每毫升NaOH标准溶液恰能与0.00364gHCl反应。这种滴定度表示方法的一般形式为TT/A，T表示滴定剂，A表示被测物质。
　　三、滴定分析的计算
　　对于任一滴定反应
　　式中，T为滴定剂，A为待测物质，P为生成物。当滴定达到化学计量点时，tmolT恰好与amolA完全作用，即
　　设待测物质和滴定剂溶液的体积分别为VA、VT，浓度为CA、CT，可导出达到化学计量点时物质的量(mol或mmol)的计算式：
　　对固体物质的质量mA和标准溶液间的关系，有
　　(1)
　　式中，VT以L计量，MA为A的摩尔质量(g/mol)，mA的单位为g。
　　在滴定分析中，体积常以mL为单位计量，将物质的摩尔质量MA化为MA/1000，其单位为g/mmol，则式(1)可写为
　　(2)
　　由式(2)和滴定度的定义可得计算滴定度的公式为：
　　(3)
　　这里关键是根据反应式搞清滴定剂和待测物的量的关系。对应用返滴定法、置换滴定法及其他间接滴定法测定的样品，搞清这个关系要从两个以上的反应找出实际参加反应的物质的量之间的关系。
　　例如，在酸性溶液中以K2Cr2O7为基准物质标定Na2S2O3溶液的浓度时，反应是分两步进行的。
　　首先，在酸性溶液中K2Cr2O7与过量的KI反应析出I2：
　　然后用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2：
　　在第一个反应中1mol K2Cr2O7产生3mol I2，而第二个反应中1mol I2和2mol Na2S2O3反应。由此可见，K2Cr2O7与Na2S2O3间接反应的摩尔比为1∶6，即
　　由式(2)可得计算Na2S2O3浓度的公式为
　　若称取试样S克，测得被测物的质量为mAg，则被测物A的百分含量是
　　在滴定分析中，该式为
　　若已知标准溶液的滴定度TT/A，可根据式(3)导出
　　四、减小滴定误差的方法
　　一般来说，滴定分析的准确度在0.2%左右。要达到这样的准确度，就应该了解分析过程中可能出现的误差来源以及如何避免。
　　1. 量器误差
　　在滴定分析中用滴定管、移液管和量瓶来测量溶液的体积，如果严格遵守量器使用规则，可使这一误差不超过0.2%。
　　滴定管读数误差为±0.02mL，因此读数不准所引起的相对误差的大小决定于标准溶液的用量。
　　读数相对误差%=0.02/标准溶液用量×100%
　　如要求相对误差为0.1%时，则标准溶液的用量至少要20mL。故一般标准溶液用量为20~30m