第一章核酸分析与分子克隆技术
一、用PCR扩增目的DNA片段
用PCR方法可以通过RT-PCR、基因组PCR、菌落PCR扩增出目的DNA片段。进行RT-PCR反应之前需要提取RNA，然后将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行RT-PCR反应；做基因组PCR之前需要提取基因组DNA，然后以基因组DNA为模板进行基因组PCR扩增目的基因，菌落PCR可直接以煮沸的菌落为模板进行PCR反应。
(一)植物总RNA的提取
RNA在细胞内并不以游离状态存在，一般都是与蛋白质结合形成核酸和蛋白质的复合体，所以如果要分离出细胞内游离的RNA分子，首先要用蛋白质变性剂来裂解细胞，使RNA分子从蛋白质和核酸的复合体中释放出来，然后通过苯酚和氯仿抽提去除蛋白质才能分离出细胞内游离的RNA分子。RNA酶非常稳定，在体外，RNA分子很容易被RNA酶降解，因此在抽提RNA的过程中需要用RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性，避免它对RNA分子的降解。我们提取RNA主要用TRIzoL法和异硫氰酸胍法，商业化出售的TRIzoL试剂中添加的RNA酶抑制剂是胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)。TRIzoL试剂的主要成分是苯酚，在提取RNA过程中苯酚的作用是裂解细胞，使细胞内的蛋白质和RNA复合体分离，然后用氯仿沉淀变性的蛋白质，用异丙醇沉淀上清液中的RNA。
1.TRIzoL Reagent(Invitrogen)法
对幼嫩的组织材料可以用TRIzoL试剂提取，Invitrogen公司生产的TRIzoL试剂质量*好，但价格昂贵；价格较优惠的国产或其他进口TRIzoL试剂也可用，但是用这些TRIzoL试剂提取的总RNA质量稍次。用TRIzoL试剂提取总RNA操作步骤如下：
(1)取植物嫩叶约0.1g于加有液氮的研钵中，充分研磨成粉末。
(2)加入1mL红色TRIzoL提取液在研钵中继续研磨成澄清的水状，室温静置5min后移入2mL离心管。
(3)加入200μL氯仿，振荡15s混匀，4℃、12000r/min离心15min。
(4)将上清液转移至新2mLEP管，加入500μL异丙醇，混匀，.20℃或室温放置10min。
(5)4℃、12000r/min离心10min。
(6)弃上清，沉淀用75%乙醇0.8～1mL清洗；4℃、12000r/min离心1min，弃75%乙醇。
(7)重复洗1次以彻底除去盐杂质。
(8)真空干燥沉淀或自然晾干，用20μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水或试剂盒自带的溶解液溶解RNA，20℃保存备用。
2.异硫氰酸胍法
对含多糖多酚的成熟组织或较老的材料如果皮、块根或块茎等，可用异硫氰酸胍法提取。1)提取液的配方(表1-1)
表1-1异硫氰酸胍法提取液的配方
2)配制方法
(1)称取表1-1中所列的固体成分全部加入100mL带刻度的试剂瓶中，加50mLddH2O，放入65℃水浴中，摇动使其溶解，*后使用ddH2O定容到100mL即可(由于异硫氰酸胍溶解会膨胀很多，所以不能加水太多，约1/2终体积即可)。使用前加入β-巯基乙醇(5mL/L)，65℃使其变澄清。
(2)2mol/L乙酸钠(pH4.2)的配制(50mL)：称取13.6g乙酸钠至烧杯中，然后添加40mL的ddH2O，置于65℃水浴溶解后，使用冰醋酸调至pH4.2，补加DEPC处理水至50mL。
(3)使用之前每100mL抽提缓冲液加入500μLβ-巯基乙醇。
3)异硫氰酸胍提取总RNA实验操作步骤
A.粗提总RNA
用液氮将1g(0.1g)组织研磨成粉末以后，转入50mL(2mL)离心管中，加入10mL(1mL)RNA提取缓冲液，再研磨一会儿后，加入1/10体积的2mol/L乙酸钠(pH4.2)。
(1)颠倒EP管数次，混匀之后，接着加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)(或只用氯仿)，盖紧离心管盖，剧烈摇动5min，冰上静置15min后，4℃离心15min(12000r/min)。
(2)离心结束后取上清于新离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动5min，冰上静置15min后，4℃离心15min(12000r/min)；
(3)取上清，加入等体积异丙醇在.20℃沉淀RNA30min，再次离心15min(12000r/min，4℃)，让RNA沉淀在管壁(如果没有沉淀，证明已经失败)。
(4)RNA沉淀经75%乙醇(DEPC水配制)清洗两次以后抽真空，加入20～50μLDEPC水(无RNase)彻底溶解RNA。
(5)1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA。
B.纯化纯化时，如果粗提RNA样品体积为0.5mL，可以稀释到2mL，使用5mLEP管纯化。
(1)首先加入等体积TE饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，盖紧离心管盖，剧烈摇动5min，冰上静置15min后，4℃离心15min(12000r/min)。
(2)取上清液，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提一次。接着加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动5min，冰上静置15min后，4℃离心15min(12000r/min)。
(3)取上清液并加入1/10体积的2mol/L乙酸钠(pH4.2)和两倍体积的无水乙醇在20℃沉淀30min。
(4)离心15min(12000r/min，4℃)，75%乙醇清洗RNA沉淀两次，风干以后用适量(20～40μL)ddH2O(无RNase)溶解，使用前置80℃保存。
C.判断RNA的质量
核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环具有双键，因此都能形成共轭双键体系，这些共轭双键体系赋予核酸吸收紫外线的特性，核酸的*大吸收波长为260nm。蛋白质中存在的芳香族氨基酸也赋予其紫外吸收特性，蛋白质的*大吸收峰为280nm。基于核酸和蛋白质的紫外吸收特性建立鉴定核酸纯度和含量的方法：RNA的A260/A280比值为2.0，DNA的A260/A280比值为1.8。当RNA样品A260/A280的比值低于2.0时，说明样品中有DNA或蛋白质污染。
(1)RNA纯度的分析方法：取2μLRNA样品，加入700μLDEPC水，使用紫外分光光度计测定其在波长260nm及280nm处的OD值，计算A260/A280比值和RNA样品的浓度。
(2)RNA完整性的分析方法：通过电泳分析来观察，未降解的总RNA电泳时在凝胶中有完整的18S和28SrRNA条带，有DNA污染时凝胶中会出现基因组DNA的条带。取1μLRNA样品于1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
3.cDNA的合成与RT反应
合成cDNA的原理：以总RNA中的mRNA为模板，以Oligo(dT)为引物在逆转录酶催化作用下进行RT反应合成第一链cDNA。再以cDNA为模板与待扩增cDNA片段的引物进行RT-PCR反应，扩增出目的基因的cDNA片段。RT-PCR对RNA检测的灵敏性很高，可以用于分析极为微量的RNA样品。RT-PCR可用于分析基因的转录水平、获取目的基因的cDNA、合成cDNA探针等。我们通常用TaKaRa或Promega逆转录酶合成cDNA。
1)RT-反应(用TaKaRa的逆转录酶)
(1)按照表1-2在EP管中加入组分1。
表1-2TaKaRaRT-反应组分1
(2)70℃10min后，迅速冰上静置2～5min。
(3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于EP管底部。
(4)再按照表1-3向EP中加入组分2。
表1-3TaKaRaRT-反应组分2
(5)42℃保温60min。
(6)70℃保温15min后冰上冷却；PCR扩增时建议模板量为1～5μL；20℃保存备用。
2)RT-PCR反应(用Promega的逆转录酶)
表1-4PromegaRT-反应组分1
(1)按照表1-4在EP管中加入组分1。
(2)70℃5min后，迅速冰上静置2min。
(3)离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于EP管底部。
(4)再按照表1-5向EP中加入组分2。
表1-5PromegaRT-反应组分2
(5)42℃保温60min，20℃保存备用。
(二)基因组DNA的制备
基因组DNA存在于细胞的染色体中，在染色体中DNA分子与组蛋白紧密结合形成DNA组蛋白复合体，因此在抽提基因组DNA时通常要利用阳离子去污剂CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)在高离子强度(>0.7mol/LNaCl)的溶液中与蛋白质结合形成复合物，释放染色体中的基因组DNA。然后通过氯仿-异戊醇抽提去除蛋白质，*后加入乙醇沉淀即可分离基因组DNA。
1.CTAB法
(1)CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
(2)称取植物叶片100mg左右置于1.5mL离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状。
(3)加入900μL预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH7.5100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.4mol/L，CTAB2%)，65℃水浴20min后取出冷却。
(4)加入500μL氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，室温离心10min(7500r/min)后转移上清至1.5mLEP管。
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