第1篇 基因工程
20 世纪70 年代以来，现代生物技术飞速发展。随着一系列新技术、新方法的不断出现，广大生物学家通过不懈的努力，开拓了许多新的研究领域，对生物科学的研究现状有了质的提升。其中，最引人注目并被公认的是以DNA 重组为中心的基因工程技术。
基因工程C gene engineering) ，又称基因操作C gene manipulation) 或重组DNA Crecombinant DNA) ，是一门以分子遗传学和分子生物学理论为基础，以生物化学和微生物学的现代方法为手段，将来源不同的遗传物质(基因)即DNA 分子，按照预先设计的蓝图， 在体外构建所需的DNA 片段，然后通过载体导入受体细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新物种(品种) ，或研究基因结构与功能的现代生物技术。
从定义可以看出，基因工程的一个重要特征，就是强调了外源DNA 分子的新组合被引入一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA 分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的。这就赋予了基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物物种间的限制，带来和扩大了定向创造新生物的可能性。这是基因工程的最大特点。
而基因工程最大的优点是打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。
自DNA 重组技术于1972 年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到了飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本篇实验在方法上，力求具有可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上， 较全面和深入理解基因工程原理，掌握基本的基因工程常用实验方法。
第1章 基因工程常用技术
基因工程技术的可行性基于以下方面的原理。
1.不同基因具有相同的遗传物质基础
地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，其基因都是一个具有遗传功能的含特定核背酸序列的DNA 片段。而所有生物的DNA 的组成和基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因(DNA 片段〉原则上是可以重组互换的。虽然某些病毒的基因定位在RNA 上，但是这些病毒的RNA 仍可以通过反转录产生DNA ，并不影响不同基因的重组或互换。
2. 基因是可以切割的
基因是以直线排列在DNA 分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA 分子上一个特定核昔酸序列的基因，可以从DNA 分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠序列的基因，也可以把其中需要的基因切割下来，但是破坏了其他的基因.
3. 基因是可以转移的
基因不仅是可以切割下来的，而且发现携带基因的DNA 分子可以在不同生物体之间转移，或者在生物体内的染色体DNA 上移动，甚至可以在不同染色体之间进行跳跃，插入靶DNA 分子之中。由此表明基因是可以转移的。
4. 多肽与基因之间存在着对应关系
普遍认为，一种多肤就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组最终可以根据其表达产物多肤的性质来考察。
5. 遗传密码是通用的
一系列三联密码子(除极少数几个外〉同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的DNA 分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转录翻译出同样的氨基酸。即使人工合成的DNA 分子(基因)同样可以转录翻译出相应的氨基酸。
6. 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代
经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。
基因工程部分的实验内容总体分为基因工程常用技术、目的基因的原核表达体系及目的基因的真核表达体系三个方面，基本流程如图1 所示。
主要包括以下实验内容。
(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA 片段或RNA 片段，同时对提取的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳分离检测.
(2) 载体的获得z 提取质粒等载体;通过PCR 技术获得大量的目的基因;在体外将带有目的基因的DNA 片段连接到具有选择标记的质粒载体上，形成重组DNA 分子。将目的基因与载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA 重新组合的过程。
(3) 将目的基因导人受体细胞:用人工的方法使体外重组的DNA 分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌(转化)或病毒(转导)侵染细胞的途径。
(4) 扩增带有重组体的细胞，获得大量的细胞繁殖群体(菌落) 。
(5) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA 分子的阳性克隆。
(6) 进一步研究分析筛选出的细胞克隆的目的基因。
(7) 将目的基因克隆到表达载体上，导人寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的各种物质。
实验1 染色体DNA 的制备一一植物总DNA 的提取
【实验目的】
(1)学习和掌握CTAB 法提取植物总DNA 的基本原理和实验技术。
(2) 学习和掌握紫外吸收法测定DNA 的纯度和浓度。
【实验原理】
在液氮冷冻下研磨植物叶片，可使细胞壁破裂，加人十六烧基三甲基澳化镀(CTAB) 和青疏基乙醇，可使核蛋白体解聚，然后使蛋白质和多糖杂质沉淀， DNA 进入水相，再用盼、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB 法，其主要作用是破膜。CTAB 能溶解膜蛋白与脂肪，解聚核蛋白。植物材料在CTAB 的处理下，结合65 'c水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐(>0. 7 mol/L)浓度条件下可溶于溶液中，并稳定存在，但在低盐浓度(0. 1~0. 5 mmol/L NaCl)条件下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24 : 1)抽提，去除蛋白质、多糖、色素等杂质，获得纯化的DNA ，最后经乙薛沉淀将DNA 分子沉淀分离出来。
核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长下都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260 nmo 纯的DNA 样品吸光度A260 /A，80 句1. 8 ，纯的RNA 样品吸光度A260/A阳电2.0 ，1μg/mLDNA溶液的A260 =0.020 。
【器材】
1.试剂
(1) 3XCTAB 缓冲液(pH8. 0):
Tris ? HC1(pH8. 0)
EDTA(pH8.0)
NaCl
CTAB
使用前加入2%(V/V)萨疏基乙醇.
(2) TE 缓冲液(pH8. 0):
100 mmol/L
25 mmol/L
1. 5 mol/L
3%
Tris ? HCl 10 mmol/L
EDTA 1 mmol/L
(3) 其他试弗U: 氯仿/异戊醇混合液(24: l ， V厅〕、95% 乙醇、液氮、新鲜的植物叶片(根据实验目的自行选择，如小白菜叶)
2. 仪器
高压灭菌锅，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，紫外分光光度计等。
【操作步骤】
(1)称取2g 新鲜的植物叶片，用蒸馆水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
(2) 将叶片剪成约1 cm 长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉未。
(3) 待液氮蒸发完后，加入15 mL预热(60 'C)的CTAB 提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65 'c水浴保温1 h ，不时地轻轻摇动混匀。
注:CfAB 缓冲渡放在65 'c水浴中预热90 min ，加入2% (V!V) 仕琉基Z醇。如果量少，可以在1.5 此的离心管中进行。注意液氮研磨时，小.t，操作，最好戴上棉布手套，以免冻伤。
(4) 加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液，
(5) 将锥形瓶中的液体倒入50 mL离心管中， 4 'C， 8000 r/min 离心10 mino
(6) 离心管中会出现3 层，用滴管小心地将上层清液吸人另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白及下层的氯仿(根据需要，上清可用氯仿/异戊醇反复提取多次) 。
(7) 收集上层清液，并将其倒人小烧杯.沿烧杯壁慢慢加人2 倍体积预冷的95 % 乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。
注:玻璃棒要缰慢沿着同-方向搅动，避免将DNA 链打断。
(8) 小心取下这些纤维状沉淀，加1~2 mL 70% 乙醇冲洗沉淀，冲洗2 次，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA 粗制品。
(9) 将粗制品溶于70%乙醇，缓和颠倒数次，4 "c ，8000 r/min 离心10 min。弃上清。
(10) 将DNA 沉淀风干，并用双蒸水溶解。
(11) 在紫外分光光度计上分别测定该榕液在260 nm 和280 nm 波长下的吸光度。
(12) PCR 操作时，吸取样品溶液1μL. 剩余样品放人-20 "c保存。
【结果】
根据测得的260 nm 和280 nm 波长下的吸光度判断提取DNA 的纯度，并估算DNA 的浓度及含量。
【思考题】
(1)自疏基乙醇和CTAB 的作用分别是什么?
(2) 液氮研磨的原理是什么?
(3) 分析实验结果，并讨论实验材料中的哪些物质对结果有影响。
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