第1章 植物生物技术概论
　　生物技术是指根据人类的需求改造生物体及其产品的技术程序，植物生物技术是各类生物技术在植物上特别是作物上的应用，旨在提高植物（作物）的产量、品质、对生物与非生物逆境胁迫的抗耐性等。生物技术*早可以追溯到远古时期人类对动植物的以大量生产为目的的驯化及采用人工选择和杂交育种的方法对动植物进行有步骤的改良。现代生物技术则是近半个多世纪来，伴随着基因组学、分子生物学、生物化学、细胞生物学、胚胎学、遗传学、微生物学、免疫学等前沿学科的迅速发展，在这些学科之间交叉而产生的一门新兴科技。生物技术的迅速进步，反过来又推动这些学科的发展。在本书中我们着重介绍的植物生物技术包括植物细胞生物技术、植物组织培养、植物基因表达研究、植物基因的克隆与DNA重组技术、植物基因编辑技术，以及分子标记辅助育种等内容。
　　1.1　生物技术的前期基础
　　现代生物技术的发展历史可以以1953年美国冷泉港实验室Watson和Crick对细胞主要遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）双链结构的发现和精准描述作为起点，之后，分子生物技术与基因组学的发展都驶入了快车道。然而，在DNA双链结构发现之前，往前追溯一两百年，生命科学领域一些其他里程碑式的重要发现，实际上已经为现代生物技术的起飞筑好了跑道。
　　1.1.1　蛋白质的发现
　　蛋白质的发现是生命科学领域一座重要的丰碑。人们对蛋白质重要性的认识经历了一个漫长的时期。麦麸（面筋）实际上就是谷物中的蛋白质，我国民间很早就知道用清水洗涤面粉团，洗去淀粉之后，分离出了麦麸（面筋），做成美味佳肴。进入18世纪，欧洲化学家A. Fourcroy等认识到鸡蛋清、血清、纤维蛋白和小麦面筋等都是一类*特的生物分子，其共同的特点是在加热或酸处理下具有凝结或絮凝的能力。蛋白质*早被命名是在1838年，由瑞典化学家J. J. Berzelius命名（Harold，1951）。“蛋白质”一词源自希腊语proteios，意思是“主要的”“领先的”“前面的”。中文的蛋白质一词来自德语Eiweissk.rper的意译，在德语中Ei（鸡蛋）、weiss（白色）、k.rper（体）*接近中文蛋白质的词义。荷兰化学家G. J. Mulder系统地对*常见的蛋白质进行了化学元素分析，他早期错误地认为所有蛋白质都由单一类型的大分子C400H620N100O120PS组成，这一结论后来很快被其他研究者和他自己所推翻。尽管酶作为一种蛋白质，早在1833年就成功地被分离纯化出来，但直到1926年，在J. B. Sumner证明尿素酶实际上是一种蛋白质之后，酶在生物体发育和代谢过程中的核心作用才得到充分认识。后来到1883年，John Kjedahl发明了一种能够准确测定氮，进而定量分析蛋白质含量的方法，这个方法一直沿用至今。随后，氨基酸被发现，氨基酸的发现是人类对蛋白质认识的飞跃。1902年，E. Fischer测定了氨基酸的化学结构，并且明确了肽键的性质。营养学家很早就认识到，蛋白质是维持身体机能*重要的营养元素。T. B. Osborne等在喂养实验室大鼠时提出并应用了Liebig*小值定律，即对动物体营养必需的氨基酸进行了界定。早期，生物化学家很难在技术上做到大批量地纯化蛋白质。因此，当时的研究相对集中在血液、蛋清中的蛋白质及消化代谢酶等可以大量纯化的蛋白质上。直到20世纪50年代，Sigma-Aldrich（西格玛-奥德里奇）公司发明了纯化牛胰核糖核酸酶A的技术，并成功纯化了1kg的牛胰核糖核酸酶A。这项技术为生物学、分子生物学和基因工程领域做出了重要贡献。
　　目前，随着测序技术、显微技术及结构生物学的发展，人们对蛋白质的认识已经到了三维结构，通过蛋白质折叠结构来预测其功能。例如，肌红蛋白是**个成功用X射线衍射技术解析晶体结构的蛋白质（图1-1）。2020年12月，谷歌旗下的DeepMind公司宣布，其开发的人工智能软件AlphaFold，可以准确地预测蛋白质的折叠，在解决困扰人类50多年的蛋白质折叠问题上迈出了重要的一步。每个活细胞内都有数千种不同的蛋白质，这些蛋白质使细胞保持活力并发挥正常的生理功能，科学家借助对蛋白质折叠的预测来理解蛋白质的功能。
　　1.1.2　**遗传学
　　19世纪另一项开创性的工作是奥地利生物学家Gregor Mendel（孟德尔）对一系列豌豆性状遗传规律的发现，从而奠定了**遗传学的基础。1856年开始，Mendel进行了长达8年的豌豆实验，从当时欧洲的蔬菜良种供应商那里买到了34个豌豆品种，并从中挑选了22个品种用于他的研究工作。他的这些豌豆品种都具有某种可以相互区分的性状，如茎秆的高或者矮、豆粒的圆形或皱缩外形、种皮的颜色（灰色、白色等）等。Mendel精心培育了这些豌豆，对不同世代的豌豆性状和数目进行了系统的观察、记载和分析（图1-2）。经过8个寒暑的辛勤劳作，他发现了植物遗传分离规律，并且开创性地用数学关系式来展现这样的规律，后人称之为“孟德尔**定律”。Mendel还发表了基因自由组合规律（“孟德尔第二定律”），这两条定律揭示了生物遗传奥秘。“孟德尔**定律”内容为，在杂合子细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的*立性；当细胞进行减数分裂时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子当中，*立地随配子遗传给后代。“孟德尔第二定律”的内容是，当具有两对（或更多对）相对性状的亲本进行杂交，在子一代产生配子时，等位基因分离的同时，非同源染色体上的基因表现为自由组合，其实质是非等位基因自由组合，即一对染色体上等位基因与另一对染色体上等位基因的分离或组合是彼此间互不干扰的，各自*立地分配到配子中去。因此，“孟德尔第二定律”也称为*立分配定律。
　　在Mendel的那个年代，绝大多数生物学家（甚至包括Mendel本人）都忽略了这些遗传学实验结果及两大定律的划时代意义。一直到1900年，孟德尔遗传定律才被一些欧洲科学家“重新发现”。其中，William Bateson的大力推广，使孟德尔的遗传学理论广为生物学界所接受，他使用了“遗传学”和“等位基因”这两个术语来进一步诠释孟德尔的遗传定律。孟德尔用数学概率论的方法描述遗传学的规律，测量了诸如种子的颜色、形状等质量性状的离散特征（性状分离比例），来描述他的观察结果。他的遗传定律是建立在大量样本观察及科学的数据分析方法基础上的，因此，他的数据具有极高的可信性。他通过跟踪观察豌豆植株特定性状连续多代（P、F1、F2、F3）的变异，并辅之以“测交”实验（将F1代与亲本之一进行杂交），揭示隐性性状的存在和后代分离比例。Mendel的实践使数学家Fisher等将概率论的原理应用于生物学实验和统计的方法得以普及，从而推动了生物统计学科的发展（Simunek et al.，2011）。
　　到20世纪二三十年代，T. H. Morgan（1866—1945）和他的助手将Mendel的理论模型与遗传的基本物质染色体结合了起来，开创了细胞遗传学的研究领域。Morgan是美国进化生物学家、遗传学家和胚胎学家，他发现了染色体的遗传机制，是现代实验生物技术的先行者。Morgan由于在1933年发现了染色体在遗传中的作用，赢得了诺贝尔生理学或医学奖。Morgan和他的同伴*早将果蝇（Drosophila melanogaster）作为一种模式生物来开展遗传学研究，他们通过对果蝇性状的观察，发现一系列遗传分离数据与Mendel的遗传定理预测的数据不相符合，无法用Mendel的“*立分配定律”来解释一些性状的遗传规律，于是，Morgan在大量实验观察的基础上，提出了“连锁定律”。根据他的理论，染色体上的基因连锁群并不像铁链一样牢靠，有时染色体也会发生断裂，甚至与另一条染色体互换部分遗传物质。因此，两个基因位点在染色体上的位置距离越远，它们之间出现分离的可能性就越大。例如，果蝇的白眼基因与小翅基因虽然同在一条染色体上，但是相距较远，当染色体彼此互换部分遗传物质（基因）时，果蝇的后代中就会出现新的类型。Morgan等的“连锁定律”和孟德尔**、第二定律一起，被称为**遗传学，**遗传学理论是现代分子遗传与分子生物技术的基础。
　　1.1.3　噬菌体的发现
　　20世纪初噬菌体的发现，也是生物技术领域重要的早期成果。1915年，英国科学家F. W. Twor在葡萄球菌（Staphylococcus）和志贺菌（Shigella）中*早发现了噬菌体（bacteriophage或phage）。噬菌体的体积小，它们的外形有蝌蚪形、微球形和细杆形等，其中以蝌蚪形多见。噬菌体由核酸和蛋白质构成，蛋白质起着保护核酸的作用，并决定噬菌体的外形和表面特征；核酸有DNA或RNA，双链或单链，环状或线状。噬菌体是一种病毒，具有病毒的一些特性，如个体微小，不具有完整的细胞结构。噬菌体能够感染、吞噬细菌、真菌、藻类、放线菌等微生物，引起宿主菌的裂解，因此可视为一种“捕食”细菌的病毒。噬菌体的基因组利用细菌的核糖体、蛋白质合成自身所需的各种氨基酸、产生能量来实现生长和增殖，是一团由蛋白质外壳包裹的遗传物质，大部分还长有“尾巴”，通过“尾巴”将遗传物质注入细菌等宿主体内。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。毒性噬菌体的繁殖与温和噬菌体的繁殖具有很大的不同。毒性噬菌体是指能够在宿主菌体内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并*终能裂解细菌的噬菌体，它们的增殖方式是复制，其增殖过程包括吸附穿入、生物合成、成熟释放三个阶段，进入细菌细胞内的噬菌体核酸*先经早期转录产生早期蛋白质，并复制子代核酸，再进行晚期转录产生噬菌体的结构蛋白，子代噬菌体达到一定数量时，在一些噬菌体合成的酶类的溶解作用下，细菌细胞便裂解，裂解过程中释放的噬菌体再感染其他细菌。温和噬菌体感染宿主菌后并不增殖，它们的基因被整合到细菌的染色体上，随细菌染色体的复制而复制，并随细菌的分裂而分配至子代细菌的染色体中。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常伴随着细菌，通常在一些充满细菌群落的地方，如泥土、动物的内脏里都可以找到噬菌体的踪迹。图1-3为典型的噬菌体外形和解剖结构、感染周期。
　　
　　
　　图1-3　典型的噬菌体外形和解剖结构、感染周期　A．肌尾噬菌体的外形；B．T4噬菌体的解剖结构和感染周期。1．噬菌体纤维和细菌的连接；2．DNA的注入；3．噬菌体成分的合成；4．新噬菌体的组装；5．细菌的溃破和感染性噬菌体的释放。
　　1952年，即1953年DNA双螺旋结构被破解的前一年，Hershey和Chase等利用标记的病毒蛋白和核酸跟踪噬菌体对细菌的附着过程，他们除去了病毒的蛋白质外壳，而只保留与受感染细胞有关的DNA物质。通过这个实验，Hershey与Chase证明了DNA具有再生大量新的病毒生长所需的全部信息，从而说明是DNA而不是之前一直认为的蛋白质是传递遗传信息*重要的物质。Hershey和Chase的这项实验，实际上与第二年Watson和Crick阐述的DNA双螺旋结构一起，共同筑建了随后半个多世纪分子生物学的重要支柱（Keen，2012）。
　　1.1.4　辐射引起的染色体变异
　　20世纪前半叶，另一项值得一提的科学发现是H. J. Muller发现的辐射能造成染色体变异现象，这一发现奠定了诱变育种的基石。Muller因在辐射（诱变）的生理和遗传效应方面的工作于1946年获得诺贝尔生理学或医学奖。Muller的一系列重大突破是从1926年开始的，那年11月，Muller用不同剂量的X射线进行了两次实验，其中第二次使用了交叉抑制原液（ClB），发现了X射线诱发基因突变的现象。*次证实X射线在诱发突变中的作用，搞清了诱变剂剂量与突变率的关系，为诱变育种奠定了理论基础。由他建立的检测突变的CIB方法至今仍是生物监测的手段之一。很快，他总结出了辐射剂量与突变发生的数学关系。Muller在柏林举行的

目录
序
前言
第1章　植物生物技术概论 1
1.1　生物技术的前期基础 1
1.1.1　蛋白质的发现 1
1.1.2　**遗传学 2
1.1.3　噬菌体的发现 3
1.1.4　辐射引起的染色体变异 4
1.2　现代生物技术发展 5
1.2.1　DNA双螺旋结构模型的提出 5
1.2.2　Sanger和蛋白质、DNA的测序 7
1.2.3　限制性内切酶的发现与应用 8
1.2.4　Taq聚合酶和聚合酶链反应（PCR） 10
1.2.5　miRNA的发现及其意义 12
1.2.6　基因组组装和基因组图谱的绘制 14
1.3　植物生物技术与作物育种 16
1.3.1　植物组织培养 16
1.3.2　植物诱变育种与TILLING技术 17
1.3.3　植物体细胞融合技术 20
1.3.4　植物基因组的多倍化与双单倍体（DH）技术 21
1.4　转基因、基因编辑和植物的遗传转化 23
1.4.1　GMO和转基因农产品的生产 23
1.4.2　基因编辑技术的发现与应用 24
1.4.3　植物的遗传转化技术 25
1.5　合成生物技术的发展 28
1.5.1　合成生物技术的发展轨迹 29
1.5.2　合成生物技术的类别 30
1.5.3　合成生物技术的应用 31
1.5.4　合成生物技术带来的安全和伦理问题 34
1.5.5　我国生命科学界对合成生物技术的基本态度 35
1.6　参考文献 35
第2章　植物细胞生物技术 38
2.1　植物细胞生物技术的细胞学基础 38
2.1.1　植物细胞壁与胞间连丝 38
2.1.2　叶绿体与线粒体 41
2.1.3　液泡和细胞质 43
2.1.4　细胞核、核膜与核孔 43
2.1.5　内质网与膜系统 44
2.1.6　细胞骨架 45
2.1.7　植物细胞的生长、分化与衰老 45
2.1.8　植物的发育与生长周期 48
2.1.9　植物的生殖生长 50
2.2　植物细胞的显微成像技术 61
2.2.1　普通光学显微镜技术 61
2.2.2　体视显微镜技术 63
2.2.3　透射电子显微镜技术 65
2.2.4　扫描电子显微镜技术 67
2.2.5　激光扫描共聚焦显微镜技术 69
2.3　标记技术在显微成像中的应用 76
2.3.1　荧光原位杂交技术 76
2.3.2　报告基因在显微成像中的作用 78
2.3.3　双分子荧光互补法研究蛋白质互作 82
2.3.4　细胞器的细胞学水平定位体系 84
2.4　单细胞测序技术 86
2.4.1　单细胞测序技术平台 86
2.4.2　植物scRNA-seq技术的发展 87
2.4.3　植物根部scRNA-seq的分析 89
2.4.4　植物地上部scRNA-seq的分析 92
2.4.5　植物单细胞测序的困难和挑战 93
2.5　参考文献 95
第3章　植物组织培养 97
3.1　植物离体培养的培养基 98
3.1.1　培养基的基本成分及其作用 98
3.1.2　培养基配制 106
3.1.3　培养基灭菌 107
3.2　植物组织器官培养 108
3.2.1　愈伤组织诱导培养 108
3.2.2　胚胎培养 111
3.2.3　外植体离体再生途径 113
3.3　植物单倍体培养 115
3.3.1　单倍体来源 115
3.3.2　单倍体培养的意义 116
3.3.3　小孢子和花药培养 117
3.4　植物原生质体培养及体细胞杂交 123
3.4.1　原生质体研究的发展及应用 123
3.4.2　原生质体分离和纯化 124
3.4.3　原生质体培养及植株再生 125
3.4.4　原生质体融合与遗传育种 127
3.4.5　植物原生质体融合方法与融合方式 129
3.4.6　体细胞**的筛选与鉴定 132
3.4.7　体细胞**的遗传分析 134
3.4.8　植物原生质体融合与遗传改良 136
3.5　植物脱毒苗培养 138
3.5.1　植物脱毒的基本原理 138
3.5.2　植物脱毒的技术规程 139
3.5.3　影响脱毒效果的因素 140
3.5.4　操作实例 141
3.5.5　植物病毒鉴定与检测技术 143
3.6　植物体细胞无性系变异及应用 144
3.6.1　体细胞无性系变异的来源 144
3.6.2　体细胞无性系变异表现及其遗传学基础 145
3.6.3　体细胞无性系变异的检测 147
3.7　参考文献 148
第４章　植物基因的表达与基因编码产物 151
4.1　基因组、基因及分子生物技术的中心法则 151
4.1.1　植物基因组简介 151
4.1.2　基因组DNA的结构与组成 152
4.1.3　DNA的调节元件和转录 154
4.1.4　RNA的种类与加工 158
4.1.5　蛋白质的翻译、译后加工和定位 160
4.1.6　基因组的表观遗传修饰 165
4.2　DNA层面的检测技术 169
4.2.1　全基因组测序技术 169
4.2.2　蛋白质-DNA相互作用检测手段 170
4.2.3　染色体构象捕获技术 172
4.3　RNA水平基因表达的检测 173
4.3.1　RNA印迹（Northern blot） 173
4.3.2　RT-PCR与RT-qPCR 174
4.3.3　报告基因的表达 176
4.3.4　RNA原位杂交 176
4.4　蛋白质水平的检测技术 178
4.4.1　蛋白质免疫印迹（Western blot） 178
4.4.2　免疫金标记和免疫组织化学 179
4.4.3　蛋白质定位的动态观察 180
4.5　基因组表观遗传修饰的检测 180
4.5.1　全基因组5mC/6mA DNA甲基化的检测手段 180
4.5.2　组蛋白修饰的检测手段 181
4.5.3　染色质可及性检测技术 182
4.6　转录组、翻译组、蛋白质组、代谢组的高通量检测 183
4.6.1　转录组的高通量检测技术 183
4.6.2　翻译组的高通量检测技术 184
4.6.3　蛋白质组的高通量检测技术 185
4.6.4　代谢组的高通量检测技术 186
4.7　参考文献 187
第5章　植物基因的克隆与DNA重组技术 189
5.1　基因片段的扩增——PCR技术 189
5.1.1　基因的概念 189
5.1.2　PCR反应的基本原理 191
5.1.3　基因片段的PCR扩增 192
5.2　基因克隆与克隆载体 195
5.2.1　基因克隆 195
5.2.2　克隆载体 196
5.3　植物的遗传转化 204
5.3.1　植物遗传转化常用载体 204
5.3.2　植物遗传转化技术和方法 206
5.4　转基因植物的分子检测 209
5.4.1　外源基因整合的分子检测 209
5.4.2　外源基因的表达检测 214
5.4.3　转基因植物检测存在的问题 217
5.5　植物目的基因的鉴定与克隆 218
5.5.1　基于已知序列的基因克隆方法 218
5.5.2　基于分子标记连锁图谱的基因克隆方法 220
5.5.3　基于人工突变体的基因克隆方法 222
5.5.4　基于表达差异的基因克隆方法 222
5.5.5　基于蛋白质分子互作的基因克隆方法 225
5.6　增强子的鉴定与功能验证 228
5.6.1　增强子的概念 228
5.6.2　增强子的特征 229
5.6.3　增强子的鉴定方法 230
5.6.4　超级增强子 233
5.6.5　增强子的功能研究 235
5.7　参考文献 235
第6章　植物基因编辑技术 238
6.1　基因编辑技术的发展与种类 238
6.1.1　巨型核酸酶（meganuclease）技术 239
6.1.2　锌指核酸酶（ZFN）技术 241
6.1.3　转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术 242
6.1.4　CRISPR/Cas9技术 243
6.2　基因编辑的一般操作步骤 245
6.2.1　基于靶序列选择合适的核酸酶 246
6.2.2　构建基因编辑分子载体 246
6.2.3　原生质体验证载体活性 251
6.2.4　基因编辑分子载体转化植物细胞或组织 251
6.2.5　植物组织培养获得基因编辑再生苗 252
6.2.6　筛选并鉴定基因编辑阳性植株 253
6.3　基因编辑导致的植物基因组修饰 254
6.3.1　双链断裂介导的随机位点突变 254
6.3.2　碱基编辑系统介导的碱基突变 254
6.3.3　引物编辑系统介导的片段突变 256
6.4　基因编辑与下一代作物育种技术 258
6.4.1　定向诱变与精准育种 260
6.4.2　多位点编辑与性状的聚合 262
6.4.3　QTL的编辑 264
6.4.4　从头（de novo）驯化 267
6.4.5　单倍体诱导与人工无融合生殖 272
6.5　挑战与未来展望 274
6.5.1　挑战 274
6.5.2　育种技术发展 275
6.5.3　未来展望 277
6.6　参考文献 278
第7章　植物生物技术在作物育种上的应用 281
7.1　分子标记辅助育种 281
7.1.1　各类分子标记的特性 282
7.1.2　遗传图谱构建 290
7.1.3　基因定位 292
7.1.4　分子标记辅助选择育种 309
7.2　TILLING技术与诱变育种 304
7.2.1　TILLING技术原理及技术改进 304
7.2.2　TILLING技术特点 308
7.2.3　TILLING技术的应用 309
7.2.4　TILLING技术发展趋势与前景 310
7.3　关联分析 310
7.3.1　连锁不平衡 311
7.3.2　关联分析的步骤和基本方法 313
7.3.3　关联定位与连锁定位的整合 318
7.3.4　全基因组选择育种 320
7.4　转基因技术与作物改良 321
7.4.1　转基因培育高产作物 321
7.4.2　转基因培育优质作物 324
7.4.3　转基因培育高抗作物 327
7.4.4　全球转基因作物生产现状 330
7.5　参考文献 335