第1章 组织学绪论
　　思维导图
　　一、组织学的研究内容
　　组织学（histology）是生物医学科学的一个主要分支，是研究机体正常微细结构及其相关功能的科学。微细结构是指在显微镜下才能清晰观察的结构。显微镜有普通光学显微镜（light microscope，LM，简称光镜）和电子显微镜（electron microscope，EM，简称电镜），所以，微细结构也分为光镜结构和电镜结构。光镜结构用长度单位微米（μm）来度量；电镜结构又称超微结构（ultrastructure），常用纳米（nm）来度量。1nm=1×10–3μm=1×10–9m。
　　组织学主要研究机体的各种组织（tissue）和器官（organ）的微细结构。组织由细胞（cell）和细胞外基质（extracellular matrix）两种成分构成。细胞是机体的结构和功能单位，其数量众多，结构、代谢和功能各异。细胞外基质由细胞产生，构成细胞生存的微环境。细胞和细胞外基质的结构和功能决定于其中的生物大分子，尤其是核酸、酶、蛋白质和蛋白聚糖等。由形态和功能相同或相似的细胞群以及数量不等的细胞外基质构成组织。按其结构和功能，人体的组织可分为4种基本类型：上皮组织、结缔组织、肌组织和神经组织。这些组织按一定的方式有机地组合，构成器官，各种器官都具有一定的大小和形态结构，并执行特定的功能。如果器官中央有大的空腔，称空腔性器官，如心、胃、膀胱等；如无大的空腔，称实质性器官，如肝、脾、肾等。由一些结构上连续或功能上相关的器官组成系统（system），完成连续的生理活动，如循环系统、消化系统、内分泌系统和生殖系统等。
　　二、组织学的研究方法
　　组织学的发展与其研究方法的进展有关，熟悉组织学的研究工具和方法是理解和掌握组织结构的前提。以下简单介绍常用的组织学研究方法。
　　（一）光学显微镜术（light microscopy）
　　应用光镜观察组织切片是组织学研究的主要技术，光镜的放大率可达1500倍左右，分辨率约为0.2μm。
　　1. 普通光学显微镜术（conventional light microscopy） 由于组织和器官太厚，不能直接在显微镜下观察，所以制备能使光线透过的组织切片是组织学研究的基本方法，主要步骤包括取材和固定、包埋和切片、染色等。*先，迅速取动物或人体的新鲜组织块，用甲醛、多聚甲醛、乙醇等固定剂固定，使组织内的蛋白质凝固或沉淀，以尽量保持组织原有的结构。然后，分别用乙醇和二甲苯将固定后的组织块脱水、透明，并用石蜡包埋，制成有一定硬度的组织蜡块，再用切片机（microtome）将其切成5～10μm厚的组织切片，贴于载玻片上。上述方法称石蜡切片法（paraffin sectioning）。也可使组织块快速冷冻变硬，进行冷冻切片，以保存蛋白质（包括酶）的活性。此外，常将血液、体液、培养的悬浮细胞等液体状材料直接涂于玻片上制成涂片；将疏松结缔组织或肠系膜等撕成薄片，铺在载玻片上制成铺片；将骨和牙等硬组织磨为薄片，称磨片。
　　染色的目的是使不同的微细结构呈现出不同的颜色，以利于镜下观察。组织学中*常用的染色方法是苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining），简称HE染色法（图1-1）。苏木精为碱性染料，将细胞核中的染色质和细胞质中的核糖体等酸性物质染成蓝紫色；伊红为酸性染料，将细胞质和细胞外基质中的碱性成分染成红色。组织结构与碱性染料亲和力强、易被染色的特性称为嗜碱性（basophilia）；与酸性染料亲和力强、易被染色的特性称为嗜酸性（acidophilia）；若与两种染料的亲和力都不强，则称为中性（neutrophilia）。另外，某些结构如肥大细胞的胞质颗粒，当用甲苯胺蓝等蓝色染料染色时呈紫红色，称为异染性（metachromasia）。当用硝酸银染色时，有些组织结构可直接使银离子还原为银颗粒而呈黑色，称为亲银性（argentaffin）；有些组织结构需要加入还原剂才能显色，称为嗜银性（argyrophilia）。
　　2. 特殊光学显微镜术（specific light microscopy） 为了观察经过荧光染料染色或标记的组织和细胞，需用荧光显微镜。荧光显微镜术（fluorescence microscopy）常以紫外光为光源，激发标本中的荧光物质产生荧光，通过观察荧光的分布与强弱来测定被检物质（图1-2）。相差显微镜术（phase contrast microscopy）主要用于观察体内分离或体外培养的活细胞的形态结构。光线通过细胞内具有不同折射率的结构时，其速度和方向发生改变，应用相差显微镜将这种改变转换为光密度差异，使活细胞的不同结构反差明显，并具有立体感（图1-3）。激光扫描共聚焦显微镜（confocal scanning laser microscopy）术应用激光和计算机对细胞内部进行光学断层扫描，产生活细胞或组织切片的三维图像，可进行一系列亚细胞水平的结构和功能研究，如测定细胞内DNA、RNA、Ca2+、pH、膜电位、细胞间通信等（图1-4）。
　　图1-1 HE染色垂体远侧部光镜图
　　1. 嗜酸性细胞；2. 嗜碱性细胞；3. 嫌色细胞
　　图1-2 人真皮微血管中膜的免疫荧光图
　　1. 平滑肌肌动蛋白（绿色荧光）；2. 细胞核（蓝色荧光）
　　图1-3 小鼠角质形成细胞原代培养（相差显微镜）
　　图1-4 小鼠原代黑色素细胞激光共聚焦免疫荧光染色图
　　1. 鬼笔环肽Phalloidin（绿色）；2. 酪氨酸酶Tyrosinase（红色）；3. 细胞核Hoechst（蓝色荧光）
　　（二）电子显微镜术（electron microscopy）
　　电镜不同于光镜之处是用电子束代替可见光，用电磁场代替玻璃透镜。电镜的分辨率约为0.2nm，可放大几万倍到几十万倍。电镜中*常用的是透射电镜和扫描电镜。
　　1. 透射电镜术（transmission electron microscopy） 透射电镜术是用电子束穿透标本，经过电磁场的汇聚、放大后，在荧光屏上显像或照相后观察。由于电子束穿透力弱，故经过固定的电镜标本需制成超薄切片（50～80nm），并用重金属盐如枸橼酸铅和乙酸铀等染色。被重金属染色的结构，电子束散射较多，射落到荧光屏上的电子少，图像暗，称电子密度高；反之，称电子密度低（图1-5）。
　　图1-5 人眼睑部位皮肤的透射电镜图
　　1. 棘细胞；2. 桥粒
　　2. 扫描电镜术（scanning electron microscopy） 扫描电镜术用于观察细胞、组织和器官表面的立体微细结构。将小块组织经固定、脱水、干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜和金属膜。扫描电镜发射的细电子束在样品表面按顺序逐点移动扫描，使样品表面金属膜发射出电子（称二次电子），二次电子信号被探测器收集，经过放大，在荧光屏上成像，图像清晰，富有立体感（图1-6）。
　　图1-6 人眼睑皮肤部位毛的扫描电镜图
　　1. 毛干；2. 表皮角质层
　　（三）组织化学技术（histochemistry）
　　组织化学技术是应用化学反应、物理学反应或免疫学反应等原理检测组织和细胞的化学成分并进行定位和定量的技术。组织细胞中的糖类、脂类、蛋白质、酶、核酸等均可与相应试剂反应，*后形成有色反应终产物或电子致密物，应用光镜或电镜进行观察。
　　1. 一般组织化学（classical histochemistry）
　　（1）多糖（polysaccharide）：常用过碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）反应显示多糖。过碘酸是一种强氧化剂，可将糖分子中的乙二醇基氧化成乙二醛基；后者再与希夫试剂（无色亚硫酸品红）结合，形成不溶性紫红色反应产物。多糖和糖蛋白均呈PAS反应阳性（图1-7）。
　　（2）脂类（lipids）：常用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等脂溶性染料染色，使脂类显色。也可用四氧化锇固定兼染色，脂肪酸或胆碱可使四氧化锇还原为二氧化锇而呈黑色（图1-8）。
　　（3）核酸（nucleic acid）：DNA可用Feulgen反应显示。用稀盐酸处理切片，使DNA水解，打开脱氧核糖与嘌呤碱基之间的连接键，暴露醛基，再与希夫试剂作用，形成紫红色反应产物。还可用甲绿派若宁染色同时显示DNA和RNA，甲绿与细胞核的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。
　　图1-7 胎鼠皮肤光镜图多糖染色（PAS染色）
　　1. 表皮中糖类（紫色）；2. 表皮；3. 真皮
　　图1-8 皮脂腺光镜图 油红O 染色
　　1. 皮脂腺分泌脂类（红色）；2. 表皮；3. 真皮
　　（4）酶类（enzymes）：细胞内酶的种类甚多，如水解酶、氧化还原酶、合成酶与转移酶等。酶组织化学技术的基本原理是：在适当的温度和pH条件下，酶催化其特异性底物水解、氧化等，形成初级反应产物；然后用捕获剂捕获该反应产物，在酶存在的部位形成不溶性、有颜色的或电子致密的反应终产物，在光镜或电镜下观察（图1-9）。
　　2. 免疫组织化学（immunohistochemistry） 免疫组织化学是根据免疫学原理，应用带有可见标记的特异性抗原-抗体反应，检测组织、细胞中多肽和蛋白质等抗原物质的一种技术，其特异性强，敏感度高。
　　进行免疫组织化学染色时，*先要获得被检多肽或蛋白质的特异性抗体，其次要对抗体进行标记。常用的标记物有荧光染料，如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、过氧化物酶（peroxidase）、生物素（biotin）和胶体金（colloidal gold）等。按其基本原理，免疫组织化学技术分为直接法和间接法（图1-10）。在直接法中，待检抗原的特异性抗体（又称初次抗体，primary antibody）被标记，用该标记抗体直接孵育标本以检测其中的抗原成分。该方法简单，特异性强，但敏感性较差。在间接法中，初次抗体不标记；使用与初次抗体种属相同的抗体的Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物，制备再次抗体（secondary antibody），并对再次抗体进行标记。染色时，顺次以初次抗体和标记的再次抗体处理标本，在抗原存在的部位形成抗原-初次抗体-标记再次抗体复合物，以达到检测该抗原的目的。间接法因再次抗体的放大作用而敏感性较高。
　　图1-9 毛乳头光镜图 碱性磷酸酶活性染色
　　1. 毛乳头碱性磷酸酶（红色）；2. 黑素颗粒；3. 毛乳头
　　图1-10 免疫组织化学的基本原理
　　间接法：1. 不标记的初次抗体；2. 标记的再次抗体。PAP 法：1. 不标记的初次抗体；2. 不标记的再次抗体；3. 标记的PAP 复合物。ABC 法：1. 不标记的初次抗体；2. 生物素标记的再次抗体；3. 标记的亲和素-生物素-酶复合物
　　目前常用的一种间接法是过氧化物酶-抗过氧化物酶法（peroxidase-antiperoxidase complex method，PAP method），其敏感性很高。在PAP法中，初次抗体和再次抗体均不标记，但需制备PAP复合物。染色时，顺次以初次抗体、再次抗体和PAP复合物孵育标本，*后以H2O2-二氨基联苯胺（DAB）显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。近年来，利用生物素（biotin）与抗生物素蛋白（avidin）的高亲和力，建立了更为敏感的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC method）（图1-10，图1-11）。